體外三維培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用及進(jìn)展

孫躍峰,江 劍,王 玲,王 宏

(1．大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 脊柱外科,遼寧 大連 116011；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 微創(chuàng)脊柱外科,廣東 廣州 510000；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科,遼寧 大連 116011)

腫瘤的發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)正逐年增加，成為威脅公眾健康的主要原因之一。一項(xiàng)調(diào)查顯示，從2002年到2012年，全球腫瘤發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)分別增加到1400萬和827萬左右[1]。2015年，中國大約有430萬腫瘤新診斷病例以及280萬人死于惡性腫瘤，相當(dāng)于平均每天有1.2萬人被診斷患有腫瘤以及7.5萬人死于惡性腫瘤[2]。因此，更加全面地理解腫瘤的發(fā)生、增殖以及轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制成為治療腫瘤的關(guān)鍵。近年來有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境(tumor environment，TME)在腫瘤增殖和進(jìn)展中具有不可替代的作用[3]。腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞成分及非細(xì)胞成分組成。其中細(xì)胞成分包括內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)、轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞(transformed epithelial cells，TEC)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)等，它們與腫瘤細(xì)胞相互作用，影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等生物學(xué)特性[4-12]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子等非細(xì)胞成分在促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長和存活、誘導(dǎo)其他細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)遷移等方面發(fā)揮著重要作用[13-14]。與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(two-dimensional cell culture，2DCC)不同，三維細(xì)胞培養(yǎng)(three-dimensional cell culture,3DCC)能夠模擬真實(shí)的細(xì)胞異質(zhì)性以及細(xì)胞微環(huán)境，并且提供了細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相互作用的信息，為細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及分子靶點(diǎn)的藥物開發(fā)和驗(yàn)證提供了新方法[15-19]。

1 無支架的3DCC

無支架的3DCC是由多種不同類型的細(xì)胞自發(fā)聚集而產(chǎn)生的細(xì)胞球狀體。該技術(shù)適用于培養(yǎng)分泌ECM蛋白并能自組裝成三維組織樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞，如炎性乳腺癌細(xì)胞。與基于支架的3DCC相比，無支架的多細(xì)胞腫瘤球體由排列松散的細(xì)胞組成，纖維連接蛋白均勻分布于整個球體內(nèi)[20-21]。

1.1 液體覆蓋法

1.1.1 瓊脂糖包被培養(yǎng)板

Charoen等[26]利用瓊脂糖包被的96孔板分別培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞，隨后將多細(xì)胞腫瘤球體嵌入膠原凝膠中，并對整個球狀體和單個細(xì)胞進(jìn)行定量和定性分析。作者認(rèn)為，該模型結(jié)合了腫瘤細(xì)胞球狀體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，在以往三維球狀體模型成功的基礎(chǔ)上，擴(kuò)展了將單個大小可控的球狀體作為腫瘤模型嵌入膠原凝膠的制備方法。此方法將促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞行為的研究，提高對新型抗腫瘤藥物的評價，加快具有數(shù)據(jù)建模和預(yù)測功能的仿真軟件的開發(fā)。Geiger等[27]為了檢測galectin-1對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡潛能、代謝活性以及它們對TF(Thomsen-Friedenreich)腫瘤抗原表達(dá)依賴性的影響，用同樣的培養(yǎng)方法對MCF-7和T-47D兩種乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了體外三維培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，在單層細(xì)胞以及球狀體細(xì)胞培養(yǎng)模型中，galectin-1能夠抑制高表達(dá)TF抗原的乳腺癌細(xì)胞的增殖和代謝活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.1.2 Poly-HEMA包被培養(yǎng)板

Kuen 等[28]為了確定誘導(dǎo)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制，建立了胰腺癌細(xì)胞、CAFs和單核細(xì)胞的三維共培養(yǎng)模型。在poly-HEMA包被的6孔板中，每孔接種2.5×105個腫瘤細(xì)胞用于單層細(xì)胞培養(yǎng)，每孔1×105個腫瘤細(xì)胞以及1.5×105個MRC-5成纖維細(xì)胞用于共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子，并且這些細(xì)胞因子可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞和骨髓源抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressive cells，MDSCs)的極化。這些共培養(yǎng)的多細(xì)胞球狀體具有抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖等免疫抑制功能，而這種功能可以被精氨酸酶1(arginase-I)等免疫抑制因子阻斷劑所部分逆轉(zhuǎn)。Choe等[29]用同樣的方法對肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行體外三維培養(yǎng)以及傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，目的是為了確定一種名為“SOX2”的多能調(diào)節(jié)因子在腫瘤細(xì)胞生長過程中的作用。作者認(rèn)為，SOX2在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)疾病進(jìn)展期間通過其下游信號傳導(dǎo)介質(zhì)AKT激酶促進(jìn)錨定非依賴性生長和化學(xué)抵抗性，使得SOX2可能成為治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。

1.1.3 超低結(jié)合培養(yǎng)板

Gebhard等[30]利用超低結(jié)合培養(yǎng)板建立了一個由犬骨肉瘤細(xì)胞構(gòu)建的無支架三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并通過光鏡和電鏡對多細(xì)胞球狀體和單層細(xì)胞進(jìn)行評價和比較。他們發(fā)現(xiàn)，多細(xì)胞球狀體顯示出獨(dú)特的I型膠原網(wǎng)絡(luò)，比單層培養(yǎng)物更接近真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境。此外，球狀體壞死中心存在大量骨鈣素，而周邊區(qū)域則以細(xì)胞增殖為主。說明犬骨肉瘤細(xì)胞所構(gòu)建的無支架三維多細(xì)胞球狀體相比單層細(xì)胞，能更好地模擬體內(nèi)腫瘤結(jié)構(gòu)，尤其是細(xì)胞—細(xì)胞及細(xì)胞—細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用。Pang等[31]成功地從原發(fā)性犬骨肉瘤和已建立的細(xì)胞系中分離出癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)，并且發(fā)現(xiàn)它們可以在6孔超低結(jié)合培養(yǎng)板中形成腫瘤球狀體以及對化療藥物具有耐藥性。進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)分離的骨肉瘤干細(xì)胞和子代黏附細(xì)胞的基因表達(dá)譜存在顯著差異，且環(huán)氧合酶-2(COX-2)在CSCs腫瘤球狀體中的表達(dá)量是子代黏附細(xì)胞的141倍。COX-2抑制劑對CSCs的生長沒有影響，卻對子代細(xì)胞球狀體的形成起到了抑制作用，這表明COX-2在腫瘤起始過程中可能發(fā)揮重要作用。

1.2 懸滴法

懸滴法是無支架培養(yǎng)三維多細(xì)胞腫瘤球體最廣泛使用的方法之一，因懸浮細(xì)胞在液滴中由于重力原因自發(fā)聚集成細(xì)胞球狀體而得名[32]。多細(xì)胞腫瘤球體的大小可根據(jù)懸浮細(xì)胞密度決定，細(xì)胞接種以后將培養(yǎng)板倒置，由于表面張力細(xì)胞懸液變成細(xì)胞懸滴保持在適當(dāng)位置不動，細(xì)胞在液滴與空氣界面處的液滴尖端積聚并增殖[33]。

Amann等[34]采用與自動化兼容的多孔懸滴微滴板，將NSCLC的兩種細(xì)胞系A(chǔ)549和COLO-699分別與肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維單培養(yǎng)或共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，與共培養(yǎng)相比，A549在單培養(yǎng)中存活率較低；而COLO-699則在單培養(yǎng)中存活率較高。同時，在培養(yǎng)過程中兩種細(xì)胞系的波形蛋白表達(dá)量增加，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)量減少。 Raghavan等[35]采用一種新穎的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型：在新型384孔懸滴陣列培養(yǎng)板中將10個卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)成單個球狀體。他們認(rèn)為，在高通量384孔板中，極少的細(xì)胞數(shù)量便可產(chǎn)生卵巢癌細(xì)胞球狀體，且具有較高的存活率。相比于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，細(xì)胞球狀體表現(xiàn)出更高的耐藥性。

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2 基于支架的3DCC

參與多細(xì)胞腫瘤球體形成的生物活性支架通常包括天然材料以及合成材料，它們不僅支撐腫瘤細(xì)胞的三維組織結(jié)構(gòu)，而且促進(jìn)細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)之間的相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖和聚集[36-37]。常見的天然支架材料有膠原、藻酸鹽、殼聚糖、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、粘多糖等[38-39]。相比于合成支架，天然支架具有更好的生物兼容性，但機(jī)械強(qiáng)度不如合成支架[40]。常見的合成支架材料有聚羥基酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基酮、聚羥基丁酸酯—共羥基戊酸酯等，它們具有比天然支架更高的機(jī)械強(qiáng)度，可用于剛性支架的構(gòu)建[41]。

2.1 天然支架

2.1.1 藻酸鹽

Akeda等[42]采用一種新型小鼠骨肉瘤三維藻酸鹽球形培養(yǎng)系統(tǒng)，將兩種具有高肺轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系Dunn及LM8包埋在藻酸鹽珠中，探究人類骨肉瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，LM8細(xì)胞系中分離細(xì)胞的數(shù)量高于Dunn細(xì)胞系。在體內(nèi)藻酸鹽珠轉(zhuǎn)移模型中，LM8細(xì)胞比Dunn細(xì)胞有更高的肺轉(zhuǎn)移率。該培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞特征和動力學(xué)反映了其在體內(nèi)的惡性潛能。

2.1.2 基質(zhì)膠及膠原

Elenjord等[43]利用三維纖絲原纖維和二維單聚體膠原體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，探究細(xì)胞膠原I相互作用對基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)合成和活化，以及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)合成的影響。他們發(fā)現(xiàn)，MMP-2的合成和活化受骨肉瘤細(xì)胞與I型膠原相互作用的影響。 Gorska等[44]在基質(zhì)膠中培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系來探究有限氧滲透對氮氧化應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)的影響。他們在檢測了細(xì)胞活力、氮氧化應(yīng)激標(biāo)志物及血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)后認(rèn)為，商業(yè)細(xì)胞株對低氧高度敏感，低氧條件可誘導(dǎo)細(xì)胞環(huán)境氧化，因此可能無法構(gòu)成良好的骨組織工程三維培養(yǎng)模型。Kim等[45]同樣利用基質(zhì)膠對膀胱癌細(xì)胞的兩種細(xì)胞系SBT31A 和T24進(jìn)行體外三維培養(yǎng)。他們研究了細(xì)胞周期蛋白D1b(cyclin D1b)小干擾RNA(siRNA)對表達(dá)cyclin D1b 信使RNA(mRNA)的人膀胱癌細(xì)胞系SBT31A和T24的抑癌作用，發(fā)現(xiàn)抑制cyclin D1b的表達(dá)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞干性及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的惡性表型。Alshareeda等[46]利用基質(zhì)膠將絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(chorionic villi derived mesenchymal stem cells，CVMSCs)與三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)細(xì)胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)，建立了體外三維共培養(yǎng)模型。他們觀察到，在MDA-MB-231與CVMSCs共培養(yǎng)體系中加入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，不僅抑制了HUVECs的血管生成能力和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖遷移能力，而且降低了MDA-MB-231特征性細(xì)胞因子的表達(dá)。

2.1.3 絲素蛋白

Talukda等[47]利用絲素蛋白支架實(shí)現(xiàn)了人乳腺癌細(xì)胞與人成骨樣細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的三維共培養(yǎng)。這種支架材料在結(jié)構(gòu)上比其他天然生物材料更耐蛋白酶降解。他們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞與成骨樣細(xì)胞通過分泌產(chǎn)物相互作用，成骨樣細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)礦化，并且共培養(yǎng)細(xì)胞在耐藥性、侵襲性和血管生成性方面有顯著提高。

2.1.4 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸同樣也可以作為構(gòu)建體外三維培養(yǎng)模型的支架材料。Xu等[48]開發(fā)了一種透明質(zhì)酸雙分子層水凝膠體系來培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞。在此雙層水凝膠結(jié)構(gòu)中的頂層含有肝素修飾的基于透明質(zhì)酸的水凝膠顆粒，并能夠以一定的速率持續(xù)釋放肝素結(jié)合的表皮生長因子樣生長因子，而嵌入底層的則是可以從頂部接收生長因子信號的前列腺癌細(xì)胞。他們認(rèn)為，與二維培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在此系統(tǒng)中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上顯著增加了兩種促血管生成因子的表達(dá)，即血管內(nèi)皮生長因子-165(vascular endothelial growth factor-165，VEGF165)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)。

2.2 合成支架

2.2.1 聚乳酸(poly lactic acid，PLA)

Polonio等[49]為了建立一種能夠使乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)富集的PLA支架，利用熔絲制造(fused filament fabrication，F(xiàn)FF)3D打印機(jī)制作出不同架構(gòu)的PLA支架并用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對其評估。他們認(rèn)為，PLA多孔支架用于體外三維培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞可以增加BCSCs的數(shù)量。

2.2.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA)

Jabbari等[50]將乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA231)、結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116)、胃癌細(xì)胞系(AGS)以及骨肉瘤細(xì)胞系(U2OS)包埋在壓縮模量為2～70 kPa的PEGDA水凝膠中，探究在不受微環(huán)境中其他因素干擾的情況下，癌細(xì)胞組織來源對PEGDA酯水凝膠中CSCs生長及標(biāo)記物表達(dá)的最佳基質(zhì)剛度的影響。他們發(fā)現(xiàn)， CSCs亞群的生長和標(biāo)記物表達(dá)的最佳基質(zhì)剛度對于MCF-7和MDA231為5 kPa，對于HCT116和AGS為25 kPa，而對于U2OS則為50 kPa。

2.2.3 納米粘土聚合物

Molla等[51]利用基于納米粘土聚合物所構(gòu)建的體外腫瘤培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬了前列腺癌在仿生骨支架上完成骨轉(zhuǎn)移定植的早期階段。他們首先將人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)接種在仿生骨支架上，隨后它們將分化為成骨細(xì)胞，形成礦化骨基質(zhì)而不含成骨補(bǔ)充劑。 最后，將前列腺癌細(xì)胞接種在種有MSCs的支架上。這種“順序培養(yǎng)”使兩種細(xì)胞自發(fā)的形成腫瘤細(xì)胞球體，并具有明顯的緊密細(xì)胞連接及缺氧核心區(qū)域。

3 結(jié) 論

本文總結(jié)了建立腫瘤相關(guān)體外三維培養(yǎng)模型所用的各種方法和材料，及其在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤等不同類型腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展。無支架體外三維培養(yǎng)技術(shù)主要包括液體覆蓋法及懸滴法；基于支架的體外三維培養(yǎng)技術(shù)主要包括天然支架(藻酸鹽、基質(zhì)膠、膠原、絲素蛋白、透明質(zhì)酸等)及合成支架(PLA、PEGDA酯、納米粘土聚合物等)。此外，體外三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型可以模擬真實(shí)的腫瘤微環(huán)境并允許細(xì)胞—細(xì)胞及細(xì)胞—基質(zhì)間相互作用，在研究腫瘤發(fā)病機(jī)理，增殖，遷移和抗藥性方面優(yōu)于傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)。然而，如何建立具有高度再現(xiàn)性及高兼容性的體外三維培養(yǎng)模型仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。