液體活檢在消化道腫瘤診療中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀

顧心怡，李賀明，王 喆，王若雨,

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 臨床學(xué)院，貴州 遵義 563003；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116001)

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)腫瘤的發(fā)病率排名中，結(jié)直腸癌排名第三位，占10.2%；胃癌排名第五位，占5.7%；全球腫瘤死亡率中，結(jié)直腸癌排名第二位，占9.2%；胃癌、肝癌并列第三位，分別占8.2%[1]。在我國(guó)，胃癌、肝癌、食道癌等消化道腫瘤占所有腫瘤發(fā)病率的50%，死亡率占36.4%。目前消化道腫瘤的診斷依靠醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)、血清腫瘤標(biāo)志物和組織活檢等方式。影像學(xué)檢查常常滯后于疾病發(fā)生，并且無(wú)法判斷微小病灶。血清腫瘤標(biāo)志物(如CEA、CA-199等)的敏感性、特異性有限。組織學(xué)活檢雖是診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)人體創(chuàng)傷大，患者依從性差，無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因此，尋找特異度及靈敏度高、患者耐受性好的檢查方法至關(guān)重要。

液體活檢是對(duì)體液(血液、唾液、腦脊液或尿液)中的物質(zhì)進(jìn)行分析，循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA 和外泌體等[2]是目前的主要檢測(cè)項(xiàng)目。液體活檢技術(shù)具有非侵襲性、可動(dòng)態(tài)觀察、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在腫瘤的臨床分期、療效及預(yù)后判斷、個(gè)體化化診療中發(fā)揮了巨大作用。

1 液體活檢的生物學(xué)基礎(chǔ)

1.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從實(shí)體腫瘤上自然脫落后進(jìn)入到血液中的癌細(xì)胞，可以單個(gè)存在也可以聚集成團(tuán)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞最早由Ashworth教授于1869年在一位癌癥患者血液中通過(guò)與其他腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行比較而發(fā)現(xiàn)的[3]。雖然CTCs的發(fā)現(xiàn)有150多年歷史，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)原因，直到近二十多年，CTCs才得到廣泛關(guān)注。血液中的CTCs數(shù)量極少,每109個(gè)血液細(xì)胞中只有1～10個(gè)CTCs[4]。因此在檢測(cè)CTCs前需要進(jìn)行富集，目前的富集方法主要有免疫磁珠分離技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)和基于腫瘤細(xì)胞大小的分離法[5-6]。但對(duì)于同一癌腫，各富集方式的結(jié)果也各不相同。因此，在臨床實(shí)施前需要進(jìn)一步細(xì)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)通常是指腫瘤細(xì)胞凋亡后進(jìn)入外周血循環(huán)的游離核酸，一般由70～200個(gè)堿基對(duì)組成[7]。1994年，首次在游離DNA中發(fā)現(xiàn)突變的KRAS基因，并證明了外周血中的突變DNA片段來(lái)源于腫瘤[8]。并且，有研究證明外周血中ctDNA數(shù)量與腫瘤負(fù)荷成正比[9]。ctDNA的半衰期時(shí)間很短，一般在15 min至2.5 h，然后被肝臟或腎臟代謝清除，因此，快速的清除時(shí)間使得臨床醫(yī)生只能對(duì)短短幾小時(shí)而不是幾周的腫瘤進(jìn)行評(píng)估[10-11]。目前ctDNA的檢測(cè)方式主要有兩大類，一類是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction PCR)技術(shù)，其敏感性較高，但只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)。另一類是基于二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)，可檢測(cè)未知突變，但檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)[12]。

1.3 外泌體

外泌體(exosome)是一種納米大小的微囊泡(直徑30～100 nm)，是由晚期多囊泡膜向內(nèi)出芽將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包裹，與質(zhì)膜融合后，外泌體被分泌到細(xì)胞外，遷移到遠(yuǎn)處，甚至跨越生理屏障，如血腦屏障。1986年，Johnstone在綿羊紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了外泌體的存在。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)其內(nèi)富含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，是參與細(xì)胞間物質(zhì)交換、信號(hào)傳導(dǎo)的重要媒介。外泌體的生物學(xué)效應(yīng)主要包括呈遞抗原、免疫調(diào)控、損傷組織修復(fù)等。研究表明，從腫瘤細(xì)胞中脫落的外泌體(TEXs)可作用于上皮細(xì)胞，促使腫瘤轉(zhuǎn)移[13]，另外，它還能下調(diào)NK細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)免疫逃逸[14]。

2 液體活檢在消化道腫瘤診療中的應(yīng)用

2.1 液體活檢在消化道腫瘤早期篩查及診斷中的作用

利用液體活檢對(duì)消化道腫瘤進(jìn)行篩查診斷和疾病復(fù)發(fā)評(píng)估已成為目前的熱門研究。ctDNA作為液體活檢中的一部分，在早期診斷中有著重要作用。ctDNA在血液中的含量較少，導(dǎo)致ctDNA檢測(cè)的陽(yáng)性率低。Molparia等[15]在一項(xiàng)研究中通過(guò)細(xì)胞游離DNA測(cè)序(cell free DNA sequencing)檢測(cè)大規(guī)模體細(xì)胞拷貝數(shù)變異(CNV)，與點(diǎn)突變檢測(cè)相比，CNV檢測(cè)檢出率更高。將25名早期結(jié)直腸癌患者作為實(shí)驗(yàn)組和24名健康者作為對(duì)照組進(jìn)行CNV檢測(cè)，區(qū)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的特異性達(dá)到100%、敏感性達(dá)到79%。Bettegowda等[16]使用dPCR技術(shù)對(duì)640例不同癌腫患者進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，分別有73%、57%、48%的非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胃食管癌、胰腺癌患者血液中檢測(cè)到ctDNA。Cohen等[17]也通過(guò)同樣的方法對(duì)221例早期胰腺癌患者進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，66例患者的血中檢測(cè)出KRAS基因突變，敏感性為30%，考慮ctDNA檢測(cè)在胰腺癌中敏感性較低，Cohen學(xué)者進(jìn)一步探究KRAS基因結(jié)合CA199是否能提高單獨(dú)KRAS基因檢測(cè)的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS基因結(jié)合CA199組的敏感性提高到了64%，在對(duì)照組中只有1例檢測(cè)到了KRAS基因突變或CA199陽(yáng)性，特異性為99.5%。因此，ctDNA檢測(cè)在大多數(shù)消化道腫瘤中的特異性和敏感性較高，可作為消化道腫瘤早期篩查和診斷的一種手段。ctDNA檢測(cè)聯(lián)合蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)可以提高檢測(cè)靈敏度。

近年來(lái)外泌體作為一種新型腫瘤標(biāo)志物得到了研究者的廣泛關(guān)注。最新的一項(xiàng)研究采用免疫印跡試驗(yàn)方法對(duì)92例結(jié)直腸癌患者和32例健康對(duì)照者的外泌體來(lái)源的CPNE3蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者CPNE3蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，并且Ⅲ～Ⅳ期患者CPNE3蛋白的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期患者。研究者進(jìn)一步繪制ROC曲線將CPNE3與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CPNE3的AUC值為0.791，其對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)的敏感性和特異性為67.4%、84.4%。而CEA的AUC值為0.728，其對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)的敏感性和特異性為54.3%、93.7%。當(dāng)CPNE3聯(lián)合CEA時(shí)，對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)的敏感性和特異性為81.2%、84.8%[18]。由此可見，CPNE3的靈敏度較高可用于結(jié)直腸癌的早期診斷及分期；將外泌體與蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)可以提高靈敏度及特異性，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。綜上，利用液體活檢技術(shù)可早期篩查和診斷消化道腫瘤，值得臨床推廣。

2.2 液體活檢在消化道腫瘤治療效果評(píng)價(jià)中的作用

液體活檢不僅可以早期篩查和診斷消化道腫瘤，同時(shí)也可以評(píng)價(jià)治療效果，指導(dǎo)臨床用藥。Chen等[19]收集了65例食管癌患者，對(duì)39例局部晚期不能直接手術(shù)的食管癌患者進(jìn)行了2周期術(shù)前新輔助化療，化療前及每周期化療后2～3周內(nèi)分別檢測(cè)CTCs，以RECIST1.1版進(jìn)行評(píng)效。達(dá)到完全緩解(complete response, CR)或部分緩解(progressive disease, PR)的患者中多次(2～3次)檢測(cè)CTC陽(yáng)性的頻率為31.8%，疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)或疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)的患者多次(2～3次)檢測(cè)CTC陽(yáng)性的頻率為70.6%(P=0.03)。對(duì)26名早期食管癌單純手術(shù)患者進(jìn)行術(shù)前及術(shù)后CTCs檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs明顯下降(P=0.037)。國(guó)內(nèi)研究也同樣證明了局部晚期食管癌新輔助放化療后CTC仍然陽(yáng)性的患者較CTC轉(zhuǎn)陰的患者中位生存時(shí)間短[20]。一項(xiàng)前瞻性的研究納入了82名轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在一線或二線化療的第一、三周期化療前采血檢測(cè)ctDNA，發(fā)現(xiàn)化療后ctDNA濃度下降組較上升組無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival, PFS)和總生存時(shí)間(overall survival,OS)長(zhǎng)[21]。多項(xiàng)研究表明在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中，ctDNA濃度隨著化療有效和獲得耐藥而升高、降低[22-23]。ctDNA在胰腺癌中的研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，ctDNA的變化與CA19-9水平、疾病進(jìn)展密切相關(guān)[24-25]。這表明ctDNA的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可能成為血液腫瘤標(biāo)志物測(cè)定的一種替代方法。ctDNA不僅能檢測(cè)藥物反應(yīng)還可以檢測(cè)耐藥基因。在藥物治療過(guò)程中，由于腫瘤微環(huán)境改變、腫瘤異質(zhì)性等多種原因可引起腫瘤細(xì)胞耐藥。ctDNA檢測(cè)RAS、BRAF和EGFR耐藥相關(guān)突變具有很高的敏感性[26-27]。Helden等[27]對(duì)接受三線西妥西單抗治療的晚期結(jié)直腸癌患者的ctDNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)治療2周期時(shí)有病灶縮小的患者血液中的ctDNA數(shù)量明顯減少，而出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)BRAF或NRAS突變總數(shù)較基線時(shí)明顯增加。Knebel等[28]發(fā)現(xiàn)在治療KRAS野生型晚期結(jié)直腸癌期間使用ctDNA監(jiān)測(cè)到KRAS抗性突變可以比影像學(xué)發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展早2個(gè)月。王蕾[29]的研究也同樣證實(shí)了實(shí)時(shí)液體活檢可以監(jiān)控耐藥基因的變化，且明顯早于影像學(xué)評(píng)估疾病進(jìn)展。由此可見，除了目前常用的腫瘤標(biāo)志物外，液體活檢技術(shù)也可以作為治療療效的監(jiān)測(cè)手段之一，同時(shí)可以檢測(cè)耐藥基因的出現(xiàn)，及時(shí)調(diào)整后續(xù)治療手段，進(jìn)一步做到精準(zhǔn)治療。

2.3 液體活檢在消化道腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)中的作用

液體活檢與腫瘤負(fù)荷有著密切的聯(lián)系，通過(guò)液體活檢可以篩選有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者，也可以了解疾病進(jìn)展和預(yù)后情況，目前的研究已表明液體活檢作為評(píng)估胃腸道腫瘤預(yù)后工具有巨大價(jià)值[25,30-31]。

一項(xiàng)包含了2363名非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的薈萃分析結(jié)果顯示，CTCs與無(wú)病生存時(shí)間(disease-free survival, DFS)和總生存時(shí)間顯著相關(guān)[32]。Herbst等[33]對(duì)467例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，檢測(cè)甲基化HPP1對(duì)預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血清中甲基化HPP1存在與疾病進(jìn)展和總生存時(shí)間縮短有關(guān)。這一結(jié)果與Tham等[34]的一致，通過(guò)對(duì)Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的甲基化TAC1和SEPT9進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了甲基化TAC1和SEPT9是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，且較CEA特異性及靈敏性高。最近一項(xiàng)研究表明，與CEA相比，ctDNA中的兩個(gè)及以上基因能夠檢測(cè)到兩倍的復(fù)發(fā)患者[35]，同樣證實(shí)了ctDNA對(duì)疾病復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)比CEA更敏感。Yao等[36]指出，ctDNA中的基因突變狀態(tài)可以作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預(yù)后指標(biāo)。液體活檢在胃癌中也同樣具有評(píng)價(jià)預(yù)后的作用[37-39]。Liu等[38]對(duì)晚期胃癌化療患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)化療后CTCs計(jì)數(shù)升高患者組比CTCs降低患者組的PFS及OS短，且基線CTCs計(jì)數(shù)>2是PFS和OS的獨(dú)立不良預(yù)后指標(biāo)。此外，CTCs數(shù)目還與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)纖維浸潤(rùn)、腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)[39]。CTCs中的存活蛋白(Survivin)表達(dá)已被證明可以作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素[40-41]。Cao等[40]在對(duì)98例接受過(guò)胃癌根治性切除術(shù)的患者的研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后存活蛋白表達(dá)程度與腫瘤浸潤(rùn)深度、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量有關(guān)。2013年的一項(xiàng)薈萃分析(包括16項(xiàng)研究和1365名患者)也指出存活蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)[41]。但有趣的是，只有細(xì)胞質(zhì)中的存活蛋白表達(dá)對(duì)總生存率有顯著影響，而細(xì)胞核中的表達(dá)對(duì)預(yù)后無(wú)影響。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)基因的改變能夠很好的提示疾病發(fā)展情況，并且可以比影像學(xué)更早預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)，降低疾病復(fù)發(fā)率。

3 小 結(jié)

液體活檢是一項(xiàng)基于體液的檢測(cè)技術(shù)，在癌癥診療中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。液體活檢的主要優(yōu)勢(shì)包括對(duì)腫瘤突變部位進(jìn)行基因分型、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、揭示耐藥性和實(shí)時(shí)選擇治療方案的實(shí)用性。液體活檢的高特異性，以及血液的同質(zhì)性，使其成為現(xiàn)代腫瘤研究中不可或缺的工具。目前液體活檢仍面臨巨大困難，首先，應(yīng)該尋找靈敏性和特異性更高的檢測(cè)方式；其次，應(yīng)規(guī)范檢測(cè)流程，包括樣本取材方式，運(yùn)輸及保存方式以及檢測(cè)方式。最后，還需要更多大樣本、多中心、大規(guī)模前瞻性臨床研究證實(shí)液體活檢對(duì)臨床診療的作用。相信在不久的將來(lái)，液體活檢能夠廣泛應(yīng)用于臨床，為患者提供更加及時(shí)、精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案。