地龍促進創(chuàng)傷修復的研究進展

田林華 董坤 張?zhí)鞄?王偉明（通訊作者）

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院 黑龍江 哈爾濱 150036）

地龍（俗稱“蚯蚓”），為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓及櫛盲環(huán)毛蚓的干燥體[1]。據《本草綱目》記載，地龍具有止痙、通絡、清熱、活血等功效，外用可治療瘰疬、潰瘍、口舌糜爛等。民間驗方用地龍白糖浸出液治療燒傷、燙傷，治愈率高且很少留有疤痕[2]，臨床上常用地龍治療創(chuàng)傷、下肢潰爛等疾病[3]?，F代研究表明，地龍活性提取物能有效縮短創(chuàng)面愈合時間，降低瘢痕發(fā)生率，且無明顯毒副作用，具有較高的開發(fā)價值。本文將近年來在地龍促進創(chuàng)傷修復的有效成分種類、分離純化和作用機制等方面研究進行綜述，以期為地龍的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1.地龍促進創(chuàng)傷修復有效成分的分離純化

地龍自身的修復損傷和再生能力很強，由此推測其體內存在能夠促進修復的物質。隨著現代生物技術發(fā)展，目前從地龍中提取出促進創(chuàng)傷修復的有效成分主要包括抗菌肽、纖溶酶、抗氧化活性物質、鎮(zhèn)痛相關物質及促創(chuàng)傷愈合物質等。

1.1 抗菌肽

抗菌肽，是各種動物、植物、微生物等的生物免疫系統(tǒng)在抵御病原微生物侵襲過程中產生的一類具有抗菌活性的多肽[4]。地龍中提取的抗菌肽，是其促進創(chuàng)傷修復的主要有效成分之一，具有熱穩(wěn)定性強、抗菌譜廣、抗菌效果強、毒副作用小等優(yōu)點。

張希春等[5]經鹽析、超濾截留小于1ku 的組分、陽離子交換色譜及反相快速蛋白質液相色譜，從地龍組織勻漿中獲得兩種對革蘭陽性菌、陰性菌和真菌均有不同抑制作用的小分子抗菌肽。崔東波等[6]采用葡聚糖凝膠柱層析對地龍蛋白粗提液進行分離純化，獲得一種對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等10 種菌都有一定的抑制作用的抗菌肽，經分析該活性肽的相對分子質量為5.5KD。Li 等[7]采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜從地龍皮膚分泌物中分離純化出一種新的抗菌肽—蚯蚓素-PG，研究表明該抗菌肽具有潛在的抗細菌和抗真菌活性。

1.2 纖溶酶

蚯蚓纖溶酶，是從地龍中提取的具有纖溶活性的組分。目前，國內外已有報道的蚯蚓纖溶酶多為含糖量在3%～15%的糖蛋白，其相對分子質量多在20 ～40KD 之間，有較高的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，具有降低血小板聚集、降低血液粘度、改善創(chuàng)面微循環(huán)的作用。

Xing 等[8]通過凝膠過濾色譜、陰離子交換色譜、疏水相互作用色譜獲得一組相對分子質量分別為29KD 和24.849KD 的蚯蚓纖溶酶（eFE-D），該組分不僅能直接水解纖維蛋白，還能激活纖溶酶原使之轉化為纖溶酶。武金霞等[9]采用親和色譜、陰離子交換色譜，從地龍勻漿液中得到一組具有纖溶酶原激活活性的糖蛋白組分，兩組兼有能直接水解纖維蛋白和激活纖維酶原活性的糖蛋白組分。周海等[10]經鹽析、膜過濾及柱層析等方法得到一組相對分子量分別為32KD 和33.5KD 的蚯蚓纖溶酶組分，該組分能顯著提高機體纖溶功能，具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。

1.3 抗氧化活性物質

氧化應激反應是機體遭受有害刺激時產生的自由基過多，超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，從而導致細胞或組織損傷的一種病理反應[11]。氧化應激反應從創(chuàng)傷開始即發(fā)生，并伴隨創(chuàng)傷修復整個過程，是影響創(chuàng)傷修復的重要因素之一[12]。地龍?zhí)崛∫褐泻胸S富的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽超氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶[13]，能促進過氧化氫代謝，減輕氧化應激反應，對抗炎癥損傷，促進創(chuàng)傷修復。

劉堰等[14]采用硫酸銨分級沉淀赤子愛勝蚓勻漿液，透析除鹽后依次通過EDAE-纖維素層析柱及Sephadex G-75 層析柱，獲得純的銅鋅超氧化物歧化酶，鄰苯三酚自氧化法測定該酶總活力為11150U，比活為5138U/mg 蛋白，回收率為20%。廖怡等[15]采用閃式提取技術結合離子交換層析聯合提取地龍中的SOD 和CAT，并通過柱層析等方法進行純化，結果表明，純化后的地龍SOD 比活達到9352U/mg，高于市售牛紅細胞SOD 標準品，純化后的地龍CAT 比活達到22606U/mg，高于市售黑曲霉CAT 和牛肝CAT。

1.4 鎮(zhèn)痛相關物質

臨床應用表明地龍對于燒燙傷和創(chuàng)傷具有良好的鎮(zhèn)痛效果，但目前對其鎮(zhèn)痛活性成分的相關研究報道較少，極大的限制了地龍的推廣應用。

程果等[16]利用PB 液抽提、鹽析及CM Sephadex C-50 陽離子交換層析等方法從地龍中分離得到2 個具有鎮(zhèn)痛活性的蛋白組分，該組分能顯著提高小鼠痛閾值，減少疼痛反應，鎮(zhèn)痛效果持久。李銳等[17]通過3KD ～50KD 超濾管截留的地龍蛋白組分具有明顯的外周鎮(zhèn)痛作用，經凝膠過濾層析、陽離子交換層析及高效液相色譜純化獲得兩個具有明顯鎮(zhèn)痛活性的組分，經測定其分子量分別為21.6KD 和28.2KD。

1.5 促創(chuàng)傷愈合物質

Hrzenjak 等[18]發(fā)現從地龍組織勻漿中獲得的糖蛋白提取物（G-90）具有促進傷口愈合的作用。崔泓等[19]將地龍粗提液經鹽析、DEAE 纖維素-DE52 離子交換層析及Sephadex G100 凝膠過濾層析，獲得一組相對分子質量分別在87KD、72KD、57KD的蛋白組分，該組分與小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）增殖存在量效關系。段曉杰等[20]以斷體地龍為研究對象，采用硫酸銨分段沉淀的方法獲得S1、S2、S3、S4 四個蛋白組分，活性篩選結果顯示S3 組分對NIH3T3 的增殖作用最強，活性蛋白濃度范圍更廣泛。

2.地龍促進創(chuàng)傷修復的作用機制

創(chuàng)傷修復是由多種類型細胞、細胞外基質成分及相關因子參與的復雜生物學過程，涉及止血和炎癥反應階段、細胞增殖和分化階段、組織重塑階段，三個階段相互交叉覆蓋[21]。研究表明，地龍活性提取物在創(chuàng)傷全過程都發(fā)揮著促進修復的作用。

2.1 止血及炎癥反應階段

2.1.1 降低血小板聚集，改善創(chuàng)面微循環(huán)

地龍活性提取物中含有膠原酶、纖溶酶等多種具有抗凝、促纖溶作用的蛋白酶，可改善血流變指數，通過降低血液黏度、降低血小板聚集、改善紅細胞變形能力，發(fā)揮活血化瘀作用[22]。呂中明等[23]通過建立微循環(huán)障礙動物模型發(fā)現，地龍?zhí)崛∥镏委熃M能明顯減少微血管中血細胞聚集團塊、加快微血流速度，體外紅細胞聚集試驗表明，在中、低切變率時，地龍?zhí)崛∥锬苊黠@改善紅細胞聚集狀態(tài)和紅細胞變形能力，提示地龍?zhí)崛∥锸且环N微血管循環(huán)改善劑。J i 等[24]研究發(fā)現，蚓激酶（L K）通過增強腺苷酸環(huán)化酶（A C）活性，上調環(huán)腺苷酸（cAMP）水平，抑制Ca2+內流，發(fā)揮抗血小板聚集活性。

2.1.2 抗炎及抗氧化

在炎癥反應階段，炎性細胞被激活并將產生大量的過氧化物，發(fā)揮殺菌、調節(jié)炎癥及信號轉導等作用[25]。當產生的過氧化物超出機體清除能力就會引起氧化應激反應，從而影響創(chuàng)傷的正常修復。地龍?zhí)崛∥锛饶苡行Ц深A炎癥反應，又能提高由SOD、CAT、GSH-PX 組成的抗氧化體系能力，清除過多的氧化產物，提高機體抗氧化能力。黃敬文等[26]發(fā)現鮮地龍?zhí)崛∫鹤饔幂^溫和，對皮膚表皮破壞較小，還具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用。Sun 等[27]發(fā)現，由地龍和水蛭組成的疏血通注射液能抑制活性氧和線粒體過氧化物生成，并通過抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等因子的表達，抑制過度的炎癥反應。Grdisa 等[28]用H2O2處理人成纖維細胞和上皮細胞前，加入地龍?zhí)堑鞍滋崛∥铮℅-90）孵育48h 細胞沒有發(fā)生氧化損傷，用H2O2處理細胞4h 后，加入G-90 可以使細胞恢復并刺激細胞生長，結果表明，G-90 具有明顯的對抗H2O2毒性和刺激細胞生長的作用。

2.2 細胞增殖、分化階段

2.2.1 對細胞的影響

成纖維細胞是主要的組織修復細胞之一。組織受損后，創(chuàng)面邊緣成纖維細胞被激活、增生并分化成肌成纖維細胞，參與創(chuàng)面收縮，增加膠原和細胞外基質成分的合成與分泌。此外，在細胞增殖、分化階段，巨噬細胞等炎性細胞和表皮細胞等修復細胞能協同成纖維細胞促進創(chuàng)傷修復[29]。地龍?zhí)崛∥锬芑罨奘杉毎?，增強吞噬活性，提高一氧化氮（NO）和TNF-α 的分泌水平，并對環(huán)磷酰胺等藥物引起的免疫抑制具有明顯拮抗作用[30]。張鳳春等[31]通過建立大白兔背部創(chuàng)傷模型發(fā)現，地龍通過促進肌纖維母細胞增生，分泌較多的肌動蛋白，促進傷口收縮，從而促進創(chuàng)傷愈合。Song 等[32]研究表明，地龍活性蛋白可能通過PI3K →Rac →PAK →MEK 信號途徑，促進小鼠胚胎成纖維細胞增殖和遷移。

2.2.2 對生長因子的影響

生長因子在創(chuàng)傷修復過程中起重要作用，它們與靶細胞上的特異受體結合，參與調控創(chuàng)傷修復多種細胞反應，影響細胞增殖、遷移、細胞外基質合成和釋放等[33]。Grdisa 等[34]發(fā)現，G-90 治療創(chuàng)面中表皮細胞生長因子（EGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）濃度遠高于健康皮膚和生理愈合創(chuàng)面，表明G-90 能有效縮短創(chuàng)面愈合時間，促進創(chuàng)傷修復。Lee 等[35]發(fā)現蚓激酶通過增加轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）及神經生長因子（NGF）的分泌，實現促進周圍神經損傷再生修復的作用。于興兵等[36]證實地龍?zhí)崛∫耗茱@著提高患者血清中血管內皮生長因子（VEGF）水平，從而促進內皮細胞增生和新毛細血管形成，為成纖維細胞的增殖及膠原的合成提供足夠的營養(yǎng)物質。

2.2.3 促進肉芽組織形成

在創(chuàng)傷中早期，細胞因子表達水平升高會促進創(chuàng)面新生血管的形成，促進皮膚再上皮化，促進膠原合成與分泌，使肉芽組織加速生長填充創(chuàng)面，從而促進創(chuàng)面愈合。Deng 等[37]推測地龍?zhí)崛∥铮‥E）促進創(chuàng)傷愈合的機制可能是通過加速羥脯氨酸（HYP）和TGF-β 的分泌，促進毛細血管形成，促進成纖維細胞增殖，增加膠原蛋白的合成與分泌，從而促進肉芽組織和表皮覆蓋。李東冰等[38]報道鮮地龍制成的溶液（創(chuàng)愈新）能明顯縮短痔瘡術后創(chuàng)面的愈合時間，加快創(chuàng)面表皮生長速度。章梅等[39]通過建立大鼠深Ⅱ度燒傷模型，研究地龍?zhí)崛∥飳?chuàng)面愈合作用的影響，結果表明地龍?zhí)崛∥锬苊黠@減輕創(chuàng)面加深程度，降低創(chuàng)面水腫程度，促進肉芽組織形成，縮短大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合時間。

2.3 組織重塑階段

2.3.1 對成纖維細胞及生長因子的影響

創(chuàng)傷修復過程中成纖維細胞經歷了增殖型、遷徙型、分泌型、肌成纖維細胞型，一旦上皮化完成，這些過程結束，成纖維細胞進入凋亡途徑而逐漸消失[40]。若成纖維細胞異常增殖，會使細胞外基質大量沉積、多種生長因子異常表達，導致創(chuàng)傷修復異常[41]。陳洪等[42]研究發(fā)現，地龍2 號能降低TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達水平，降低細胞外基質合成，減輕大鼠肝纖維化程度。黃敬文等[43]實驗表明，地龍蛋白通過下調細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達抑制人增生性瘢痕成纖維細胞（HSF）增殖，通過上調半胱天冬酶-3（Caspase-3）的表達，下調T G F-β1、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B c l-2）的表達誘導H S F細胞凋亡。

2.3.2 減少病理性瘢痕的形成

瘢痕是創(chuàng)傷修復的必然結果，但炎癥反應過度、膠原合成與降解失衡等均會導致創(chuàng)傷修復異常，從而形成病理性瘢痕。吳俊榮等[44]采用鮮地龍勻漿液外敷不僅能明顯促進創(chuàng)傷愈合，還能減少創(chuàng)面炎性反應，減少成纖維細胞數量和膠原合成，從而減輕兔耳增生性瘢痕纖維化程度。黃敬文等[45]對兔耳增生性瘢痕組織中Ⅰ膠原、Ⅲ膠原和基質金屬蛋白酶-1(MMP-1) mRNA的表達水平進行檢測，結果表明，地龍通過抑制Ⅰ膠原的表達，促進Ⅲ膠原及MMP-1 的表達，實現抑制膠原合成、促進膠原降解、減少增生性瘢痕形成的作用。

3.結論

地龍?zhí)崛∥锎龠M創(chuàng)傷修復作用緩和、療效確切、無明顯毒副作用，是外用中藥治療創(chuàng)傷的新熱點。目前，關于地龍促進創(chuàng)傷修復的研究尚存在一些問題：一是國內外關于地龍促進創(chuàng)傷修復有效成分的分離純化及結構鑒定多集中于纖溶酶、抗菌肽和抗氧化活性物質，對鎮(zhèn)痛相關物質和促創(chuàng)傷愈合物質的報道較少；二是雖然臨床實踐表明，地龍對于燒傷、燙傷等難愈性創(chuàng)傷的治療作用顯著，但由于創(chuàng)傷修復是一個極為復雜的動態(tài)過程，關于地龍促進創(chuàng)傷修復作用機制的研究還處于初級階段，具有較大的探索空間；三是關于創(chuàng)傷修復的研究一般包括動物模型、臨床觀察、細胞培養(yǎng)等方式，但由于動物與人在皮膚結構上有較大的差異，創(chuàng)傷修復機制也有所不同，選擇理想的動物模型極為困難，因此加強動物實驗模型的研究，有助于從不同水平上深入認識地龍促進創(chuàng)傷修復的機理。