白細胞介素-7 促進原發(fā)性腎病綜合征患兒外周血CD14+單核細胞活性

劉 君 馮仕品

電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童腎臟內科（四川成都 610017）

兒童原發(fā)性腎病綜合征（idiopaticnephrotic syndrome，INS）是多種病因造成的腎小球基底膜通透性增高，導致蛋白從尿中排出，表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高脂血癥及其他代謝紊亂[1]。INS的病因尚未完全闡明，目前認為免疫系統功能失調、系統性循環(huán)因子異常分泌、腎臟足細胞遺傳性結構異常等因素均參與了INS發(fā)病[1-2]。在非遺傳因素中，多種免疫細胞和細胞因子功能失調所造成的免疫紊亂是INS的重要誘因之一[3]。白細胞介素-7（interleukin-7，IL-7）主要通過IL-7受體α鏈（即CD127）發(fā)揮作用，IL-7/CD 127 信號通路調控并維持免疫細胞分化、發(fā)育和增殖，在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。IL-7還可增強肺癌患者CD14+單核細胞的抗原提呈功能，誘導CD4+T細胞活化[5]。既往研究發(fā)現，激素敏感型INS患兒血清IL-7水平升高，且與機體凝血功能密切相關[6-7]。但有關IL-7對INS患者免疫細胞的調節(jié)作用尚未見相關報道。因此，本研究利用體外細胞培養(yǎng)系統，觀察IL-7對INS患兒CD14+單核細胞活性的影響，初步探討IL-7在INS發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月—2019年7月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童腎臟內科住院的INS患兒。研究對象入選標準：①年齡＜16歲；②診斷符合中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組2016年指南[8]，即24 h尿蛋白定量＞50mg/(kg·d)，血清膽固醇＞5.7 mmol/L，血清白蛋白＜30 g/L；③未經糖皮質激素治療；④排除慢性病毒感染、自身免疫性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、重要臟器功能衰竭等疾病。選擇同時期在本院體檢中心接受健康查體的兒童作為對照組，入選標準：①年齡＜16歲；②體檢健康，無遺傳代謝性疾病；③近半年內無其他疾病史。

本研究方案通過成都市婦女兒童中心醫(yī)院倫理委員會批準，入組患兒法定監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞分離 清晨空腹采集外周靜脈血20 mL，EDTA 抗凝。使用人外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶公司）、采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），調整細胞濃度至2×107個/mL，加入含10%DMSO的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CD 14+單核細胞和CD 4+T 細胞分選和培養(yǎng) 采用磁珠分選法、使用人CD 14 MicroBeads（德國美天旎公司）和人CD4+細胞分選試劑盒（德國美天旎公司）對PBMC中CD14+單核細胞和CD4+T細胞進行分選，操作按說明書要求進行。分選的細胞使用含10% FBS的RPMI 1640于37 ℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。從33 例INS 組中選取10 例INS 患兒分選的105個CD14+單核細胞，接種于96孔板，設立4個復孔，其中2 個復孔加入培養(yǎng)液，另外2 個復孔加入重組人IL-7（25 μg/L，美國Peprotech公司）刺激培養(yǎng)，12h后收集培養(yǎng)上 清。

1.2.3 CD 14+單核與CD 4+T 細胞共培養(yǎng)系統建立 選擇17 例INS 患兒和7 例對照組純化的CD 14+單核細胞，加入的重組人IL-7（25 μg/L）刺激培養(yǎng)12h，洗滌后建立間接接觸和直接接觸共培養(yǎng)系統[9]。間接接觸培養(yǎng)系統：兩種細胞以1:1的比例分別接種于Transwell培養(yǎng)平板上層小室與下層培養(yǎng)孔中，向下層培養(yǎng)孔中加入抗CD3抗體（1 μg/L）。直接接觸培養(yǎng)系統：兩 種細胞以1:1的比例直接混合，加入抗CD3抗體（1 μg/L）。將CD4+T細胞單獨培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)48 h后收集細胞。另取8例INS患兒CD14+單核細胞 與自體CD 4+T細胞建立直接接觸共培養(yǎng)系統，向培養(yǎng)液中加入抗人IL-6 中和抗體（20 ng/mL，美國Invi vogen公司），培養(yǎng)最后12 h加入布雷非德菌素A（10μg/mL）。

1.2.4 CD 127 表達以及CD 4+T 細胞分泌 干擾素-γ（IFN-γ）和IL-17的檢測采用流式細胞術檢測。PBMC 使用抗人CD-14-FITC 和抗人CD 127-PE 染色，4 ℃避光孵育30 min。CD14+單核細胞與CD4+T細胞 共培養(yǎng)的細胞加入抗人CD 4-PerCP 4 ℃避光孵育30 min，破膜后加入抗人IFN-γ-APC和抗人IL-17-PE，4 ℃避光孵育20 min。流式抗體購自美國BD公司。使用FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）獲取細胞，FlowJo10.6軟件分析結果。

1.2.5 CD 14+單核細胞CD 127 mRNA 檢測 采用實時定量PCR 進行檢測。105個CD 14+單核細胞使用RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）抽提總RNA，取1 μg 總RNA，使用PrimeScript 反轉錄試劑盒（北京寶日生物技術有限公司）進行反轉錄，-20 ℃保存cDNA。使用TB Green實時定量PCR試劑盒（北京寶日生物技術有限公司）進行PCR 反應。引物序列為，①CD 127 上游：5’-AAA GTT TTA ATG CAC GAT GTA GCT T-3’；CD127下游：5’-TGT GCT GGA TAA ATT CAC ATG C-3’。②GADPH上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’；GAPDH下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。每個樣本做3個重復，在ABI 7500實時定量PCR儀（美國Applied Biosystem公司）上進行檢測。

1.2.6 培養(yǎng)上清中細胞因子表達檢測 采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。使用ELISA 檢測試劑盒檢測血清IL-7 水平、培養(yǎng)上清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、人單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。所有ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司，操作按說明書要求進行。

1.3 統計學分析

使用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用裂區(qū)設計資料的方差分析或單因素方差分析，存 在差異后進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，兩組 間比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數（四分位數范圍）表示，組間比 較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

共納入INS組患兒33例，男23例、女10例，年齡3.0～13.0 歲，平均年齡（6.9±2.9）歲，發(fā)病時間7.0～30.0 d，平均病程（20.0±8.0）d，24 h 尿蛋白（4.1±1.8）g，血清白蛋白（20.0±6.0）g/L，膽固醇（6.8±1.4）mmol/L。其中24 例表現為單純型，9 例表現為腎炎型。對照組15 例，男11 例、女4 例，年齡4～14歲，平均年齡（7.9±2.5）歲。兩組性別構成、年齡、身高、體質量、體質指數比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 血清IL-7及CD14+單核細胞中CD127表達

INS 患兒血清IL-7 水平高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。CD 14+單核細胞中CD 127 平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）的典型流式圖檢測見圖1。

CD14+單核細胞中CD127 MFI和mRNA的相對表達量在對照組和INS患兒之間的差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 對照組和INS患兒一般情況、血清IL-7及CD14+單核細胞中CD127表達比較

圖1 CD14+單核細胞中CD127 平均熒光強度典型流式細胞檢測圖

2.3 IL-7對CD14+單核細胞分泌炎癥細胞因子影響

經IL-7 刺激的CD 14+單核細胞分泌IL-1 β、IL-6、IL-8、MCP-1和TNF-α的水平高于無IL-7刺激的CD 14+單核細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 IL-7刺激對CD14+單核細胞誘導的CD4+ T細胞活化的影響

使用IL-7 刺激CD 14+單核細胞后，分別建立CD 14+單核細胞與自體CD 4+T 細胞間接接觸和直接 接觸共培養(yǎng)系統，CD 4+T 細胞單獨培養(yǎng)為對照組。培養(yǎng)48 h后檢測CD4+T細胞分泌IFN-γ（Th1細胞） 和分泌IL-17（Th17細胞）的比例，典型流式散點圖見圖2。

采用裂區(qū)設計的方差分析對INS 分選細胞和對照組分選細胞中Th1和Th17細胞比例的差異進行分析。培養(yǎng)方法作為一級處理因素，是否加入IL-7作為二級處理因素。INS分選細胞中，培養(yǎng)方法和是否加入IL-7兩因素的交互作用有統計學意義（FA×B=15.79、11.09，P＜0.001），直接接觸培養(yǎng)中Th 1 和Th 17 細胞比例均高于間接接觸培養(yǎng)系統（FA=50.67、34.94，P＜0.001），IL-7 對Th 1 和Th 17 細胞比例有影響（FB=23.68、17.27，P＜0.001）。進一步分析發(fā)現，在間接接觸培養(yǎng)系統中，無IL-7刺激和經IL-7刺激Th1和Th17細胞比例與CD4+T細胞單獨培養(yǎng)的差異均無統計學意義（P＞0.05），在直接接觸培養(yǎng)系統中，Th1和Th 17 細胞比例均顯著高于CD 4+T 細胞單獨培養(yǎng)（t=5.226、3.934，P＜0.01）；經IL-7 刺激后，Th 1 和Th17細胞比例顯著高于無IL-7刺激（t=3.544、3.548，P＜0.01）。見表3。對照組分選的細胞中，培養(yǎng)方法和是否加入IL-7 兩因素的交互作用有統計學意義（FA×B=4.281、3.358，P＜0.05），直接接觸培養(yǎng)中Th1和Th17細胞比例均高于顯著高于間接接觸培養(yǎng)系統（FA=14.82、7.934，P＜0.01），IL-7對Th1和Th17細胞比例有影響（FB=3.814、5.638，P＜0.05）。在直接接觸培養(yǎng)系統中，經IL-7刺激后，Th1和Th17細胞比例顯著高于無IL-7刺激（t=3.999、4.150，P＜0.01）。見表3。

2.5 抗IL-6抗體對IL-7介導INS患兒CD14+單核細胞誘導CD4+ T細胞活化的影響

表2 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞分泌細胞因子影響(，pg·mL-1)

表2 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞分泌細胞因子影響(，pg·mL-1)

圖2 典型流式細胞檢測圖

INS患兒CD14+單核細胞在IL-7刺激后，與自體CD 4+T 細胞直接接觸共培養(yǎng)，并向培養(yǎng)液中加入抗人IL-6中和抗體。

無刺激組、經抗IL-6 刺激組、經IL-7 刺激組、經IL-7+抗IL-6刺激組4組之間Th1比例差異有統計學意義（F=3.67，P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現，經IL-7 刺激組Th1比例均高于無刺激組和經IL-7+抗IL-6刺激組（P＜0.05）。見表4。

3 討論

IL-7 在感染、腫瘤和自身免疫性疾病中均發(fā)揮重要的免疫調控作用，通過CD 127 介導的信號通路增強CD 8+T 細胞殺傷功能，促進病原體和腫瘤細胞的清除[10-11]。人類免疫缺陷病毒慢性感染患者接受IL-7治療可降低血漿可溶性CD14表達，提示IL-7可降低機體系統性炎癥[12]。相反，IL-7外顯子5缺陷基因編碼的蛋白刺激可誘導CD 14+單核細胞促炎因子表型，增加脂類代謝相關基因表達[13]。本研究發(fā)現，INS患兒外周血IL-7表達升高，這與既往的研究結果一致[6-7]。但IL-7對INS患兒CD14+單核細胞調控作用的研究較少。本研究發(fā)現，CD14+單核細胞表面的模型CD127蛋白和總CD127（模型和可溶型）mRNA相對表達量在對照組和INS患兒之間的差異無統計學意義，與在肝癌患者中的研究結果一致[14]，提示炎癥和腫瘤均未改變單核細胞中CD127的表達，INS患兒CD14+單核細胞對IL-7的反應性升高與CD127水平無關。而IL-7刺激可促進INS患兒CD14+單核細胞分泌炎癥細胞因子，提示INS患兒中升高表達的IL-7可增強CD14+單核細胞促炎功能，誘導INS病程中的炎癥應答，促進疾病進展。

在類風濕性關節(jié)炎患者中，CD 14+單核細胞可誘導CD 4+T 細胞活化的過程依賴兩種細胞的直接接觸[5]。本研究發(fā)現，CD14+單核細胞在間接接觸共培養(yǎng)系統中不能誘導Th 1 和Th 17 的表型活化，僅在CD 14+單核細胞和CD 4+T 細胞直接接觸的條件下，CD 14+單核細胞才能有效介導INS 患兒CD 4+T 細胞 向Th 1 和Th 17 細胞的活化，這與既往的研究結果一致[5,9,15]。提示CD14+單核細胞主要通過其抗原提呈功能誘導CD 4+T 細胞活化，但細胞因子分泌在這一過程中是否發(fā)揮作用尚不清楚。由于IL-7主要通過促進IL-6分泌誘導病毒特異性CD8+T細胞和濾泡輔助性T 細胞的活性[10,16]，而本研究發(fā)現，在INS 患兒中，IL-7均可增強CD14+單核細胞誘導的CD4+T細胞活化，說明IL-7可促進CD14+單核細胞功能。而抗IL-6中和抗體可抑制IL-7誘導的CD14+單核細胞對CD4+T細胞的調控作用，提示在INS患兒中，CD14+單核細胞對CD4+T細胞的調控作用亦有賴于IL-6的分泌。然而本研究具有一定局限性，未設立治療前后INS 患兒的對比，因此，IL-7 對INS 患兒CD 14+單核細胞的調控機制仍有待深入探討。

綜上，INS 患兒升高表達的IL-7 可促進CD 14+單核細胞分泌炎癥細胞因子，IL-7 刺激的CD 14+單核細胞可能通過直接接觸和分泌IL-6 誘導INS 患兒CD4+T細胞活化，提示IL-7可增強CD14+單核細胞的功能，在INS 中發(fā)揮促進炎癥影響、誘導疾病進展的作用。

表3 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞誘導Th1和Th17細胞活化影響(，%)

表3 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞誘導Th1和Th17細胞活化影響(，%)

注：1)與CD4+單獨培養(yǎng)比較，P＜0.05；2)與CD4+/CD14+直接接觸無IL-7刺激比較，P＜0.05；3）一級處理因素；4）二級處理因素；5）一級處理因素和二級處理因素的交互作用

表4 抗IL-6抗體對IL-7介導的CD14+單核細胞誘導Th1/Th17活化影響(，%)

表4 抗IL-6抗體對IL-7介導的CD14+單核細胞誘導Th1/Th17活化影響(，%)

注：1)與無刺激組比較，P＜0.05；2)與經IL-7刺激組比較，P＜0.05