支氣管哮喘患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)及其與肺功能和氣道炎癥的關(guān)系

郝莉霞 劉慶 馬曉鵬 孫瑞雪

支氣管哮喘是臨床常見(jiàn)的一種由多種炎性細(xì)胞及其組分參與的以持續(xù)氣道炎癥為特征的呼吸系統(tǒng)疾病。該疾病多于夜間或凌晨發(fā)作、加劇，因可逆性呼氣氣流受限會(huì)引起咳嗽、胸悶、喘息、氣促、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)發(fā)紺，極大降低患者的生活質(zhì)量。臨床目前尚無(wú)能完全根治該疾病的有效方法，常以長(zhǎng)期服用藥物緩解癥狀[1-3]。S100A8、S100A9是由鈣結(jié)合蛋白S100A8和S100A9組成的異源二聚體，屬于S100蛋白家族的一員，主要由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生[4]。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，S100A8、S100A9蛋白可促進(jìn)呼吸道的炎癥反應(yīng)，但至今關(guān)于其表達(dá)水平與支氣管哮喘的相關(guān)性研究甚少，基于此，本研究對(duì)支氣管哮喘患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)及其與肺功能和氣道炎癥的關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為臨床尋找能較為準(zhǔn)確反映支氣管哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)的可靠指標(biāo)。現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選取2018年4月至2019年4月本院接治的80例支氣管哮喘患兒作為研究對(duì)象設(shè)為患病組，根據(jù)疾病嚴(yán)重程度[6]分為重度組25例，中度組28例和輕度組27例；同期20例健康體檢兒作為對(duì)照組。患病組男43例，女37例；年齡6～14歲，平均(8.87±1.84)歲；病程0.7～2年，平均(1.01±0.24)年。健康對(duì)照組男11例，女9例；年齡7～14歲，平均(9.01±1.65)歲；。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

診斷參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中的相關(guān)規(guī)定[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，并確診為支氣管哮喘患者；②納入研究前1周未接受過(guò)免疫治療，未應(yīng)用過(guò)抗組胺藥、皮質(zhì)激素及茶堿等藥物；③配合本次研究，并已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重心血管疾病患者；②有慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肺癌等病史者；③有自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病等家族病史者；④有精神障礙，無(wú)法配合本研究者。該研究已由本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

三、方法

①血清S100A8、S100A9表達(dá)情況測(cè)定：采用RT-PCR法測(cè)定患者空腹外周靜脈血中100A8、S100A9的表達(dá)情況。具體如下：1) 加入TRIzol試劑提取研究對(duì)象外周血單核細(xì)胞中總RNA；2) 對(duì)1.0 mg RNA行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；3) PCR反應(yīng)：設(shè)計(jì)引物及選定內(nèi)參(見(jiàn)下表1)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件依次為：95℃下10 min；95℃下15 s；60℃下1.0 min，共進(jìn)行40次循環(huán)；4. 每個(gè)樣品測(cè)量3次，結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用2-DDCt法進(jìn)行分析，計(jì)算S100A8、S100A9的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用試劑盒及引物均來(lái)自于Sigma-aldrich有限公司。②肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%的測(cè)定：應(yīng)用St-75肺功能儀(廠家：日本福田產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)對(duì)患者肺功能進(jìn)行檢查，測(cè)定患者FEV1/FVC%和FEV1%值；③外周血EOS計(jì)數(shù)和血清總IgE測(cè)定：抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)外周血6.0 mL，離心后(3000 r/min，15 min)，分離血清和血細(xì)胞；用常規(guī)計(jì)數(shù)法檢測(cè)EOS絕對(duì)數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)患者血清總IgE水平；ELISA試劑盒購(gòu)買(mǎi)于泉州市睿信生物科技有限公司，由專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)人員依照說(shuō)明書(shū)完成檢測(cè)(見(jiàn)表1)。

表1 S100A8、S100A9及內(nèi)參β-actin序列

四、觀察指標(biāo)

①血清S100A8、S100A9表達(dá)量：測(cè)量不同程度患病組及健康對(duì)照組血清S100A8、S100A9表達(dá)量；②肺功能指標(biāo)及外周血EOS計(jì)數(shù)、血清總IgE水平：測(cè)量所有納入對(duì)象肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%、血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)；③相關(guān)性分析：應(yīng)用Pearson軟件分析支氣管哮喘患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)量與FEV1/FVC%、FEV1%及血清總IgE水平、外周血EOS計(jì)數(shù)的關(guān)系；④診斷價(jià)值評(píng)估：應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)血清S100A8、S100A9表達(dá)對(duì)疾病支氣管哮喘的診斷價(jià)值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同程度患病組和健康對(duì)照組血清S100A8、S100A9表達(dá)情況比較

患病組和對(duì)照組各組間血清S100A8、S100A9表達(dá)情況比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；任一患病組血清S100A8、S100A9表達(dá)量均高于健康對(duì)照組(P<0.05)；3組不同患病程度患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而不斷升高，且比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 不同程度患病組和健康對(duì)照組血清S100A8、S100A9表達(dá)情況比較

二、不同程度患病組和健康對(duì)照組肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%比較

患病組和對(duì)照組各組間肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且任一患病組FEV1/FVC%和FEV1%指標(biāo)都顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)；3組不同患病程度患兒FEV1/FVC%和FEV1%指標(biāo)隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而不斷降低，且比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 不同程度患病組和健康對(duì)照組肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%比較

三、不同程度患病組和健康對(duì)照組血清總IgE水平和外周血EOS計(jì)數(shù)比較

患病組和對(duì)照組各組間血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且任一患病組血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)都高于健康對(duì)照組(P<0.05)；3組不同患病程度患兒血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)均隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而不斷增加，且比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

四、患病組血清S100A8、S100A9表達(dá)與其肺功能各指標(biāo)(FEV1/FVC%和FEV1%)及血清總IgE水平、外周血EOS計(jì)數(shù)的關(guān)系

支氣管哮喘患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)水平均與肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%呈中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，與血清總IgE水平有較強(qiáng)的正相關(guān)，而與外周血EOS計(jì)數(shù)有較弱的正相關(guān)(見(jiàn)表5、6)。

表4 不同程度患病組和健康對(duì)照組血清總IgE水平和外周血EOS計(jì)數(shù)比較

表5 患病組血清S100A8 mRNA表達(dá)量與肺功能各指標(biāo)及總IgE、EOS計(jì)數(shù)的關(guān)系

表6 患病組血清S100A9 mRNA表達(dá)量與肺功能各指標(biāo)及總IgE、EOS計(jì)數(shù)的關(guān)系

五、血清S100A8、S100A9表達(dá)量及總IgE對(duì)支氣管哮喘疾病的診斷價(jià)值

(見(jiàn)圖1)從ROC曲線分析可知：血清S100A8、S100A9表達(dá)量及總IgE的AUC分別為0.880(95%CI：0.813～0.947)，0.861(95%CI：0.784～0.939)，0.843(95%CI：0.767～0.918)，對(duì)應(yīng)的最佳臨界值分別為 1.572，1.314，217.833 IU/mL，此時(shí)靈敏度和特異性分別為(72.50%，95.00%)，(88.80%，75.00%)，(72.50%，90.00%)。

討 論

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道疾病，具有反復(fù)發(fā)作性、治療長(zhǎng)期性的特點(diǎn)。該疾病強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間發(fā)生改變，若不及時(shí)診治，可導(dǎo)致氣道不可逆性縮窄和氣道重塑。引起支氣管哮喘發(fā)生的因素有很多，主要包括環(huán)境因素如空氣中的過(guò)敏原、病毒感染、神經(jīng)內(nèi)分泌及遺傳等因素。該疾病根治較難，一般僅能通過(guò)藥物治療或長(zhǎng)期護(hù)理控制或緩解病癥，減少疾病的發(fā)作次數(shù)[8-9]。目前，臨床缺乏較為理想的能進(jìn)行早期診斷和病情評(píng)價(jià)的指標(biāo)。鈣蛋白S100A8和S100A9在機(jī)體中主要以S100A8、S100A9二聚體的形式發(fā)揮作用。其可通過(guò)結(jié)合Ca+加速吞噬細(xì)胞遷移、增強(qiáng)細(xì)胞核因子活性、提高活性氧水平，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的加重[10-11]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，S100A8、S100A9與糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤及肺疾病等密切相關(guān)。王莉霞等人[14]對(duì)S100A8、S100A9與2型糖尿病及其慢性并發(fā)癥的關(guān)系作了綜述，闡明了其在疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。陳小菊等人[10]對(duì)S100A8、S100A9在不同分期慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺)患者血漿和誘導(dǎo)痰中的水平及其與患者肺功能和血漿中炎癥介質(zhì)的相關(guān)性分析進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步探討了其在疾病發(fā)生中的作用，結(jié)果表明，慢阻肺患者體內(nèi)S100A8、S100A9合成和釋放顯著增多，其水平的高低與患者氣流受限嚴(yán)重程度和血漿炎癥介質(zhì)水平相關(guān)，推測(cè)S100A8、S100A9可能通過(guò)參與炎癥機(jī)制介導(dǎo)慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。

圖1 血清S100A8、S100A9表達(dá)量及總IgE診斷支氣管哮喘疾病ROC曲線

相關(guān)研究顯示[10]，S100A8、S100A9在產(chǎn)生炎癥的機(jī)體血清或組織中表達(dá)會(huì)升高，該結(jié)果與本研究相似。本研究中，相較于健康兒童，S100A8、S100A9在支氣管哮喘患兒血清中表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)水平會(huì)隨疾病嚴(yán)重程度的加重而不斷增加，即重度組>中度組>輕度組。目前臨床最常用的評(píng)價(jià)哮喘患者肺功能的指標(biāo)主要有FEV1/FVC%和FEV1%，本研究中，疾病組患者的FEV1/FVC%和FEV1%顯著低于健康對(duì)照組，且隨著疾病嚴(yán)重程度的加重而不斷降低，即重度組<中度組<輕度組；該結(jié)果提示哮喘會(huì)嚴(yán)重危害患者的肺功能，降低患者生活質(zhì)量，應(yīng)盡早進(jìn)行診斷并接受治療，阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展。另外，支氣管哮喘是一種以氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，說(shuō)明該疾病的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究中，以血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)為指標(biāo)來(lái)評(píng)估疾病的炎癥程度，結(jié)果顯示，疾病組患者血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)都明顯高于健康對(duì)照組，且疾病越嚴(yán)重，兩者的水平越高；該結(jié)果與前人研究一致[15-16]。另外，評(píng)估了患兒血清S100A8、S100A9表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果表明，血清S100A8、S100A9表達(dá)與FEV1/FVC%和FEV1%呈負(fù)相關(guān)，而與血清總IgE水平及外周血EOS計(jì)數(shù)呈正相關(guān)；推測(cè)S100A8、S100A9因子也可能是通過(guò)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)促進(jìn)支氣管哮喘疾病的發(fā)展。ROC評(píng)估結(jié)果顯示，血清S100A8、S100A9表達(dá)對(duì)支氣管哮喘均有一定的診斷價(jià)值(S100A8和S100A9的AUC分別為0.891、0.878)，且兩者均比血清總IgE的診斷價(jià)值高(總IgE的AUC為0.843)，可作為疾病發(fā)生的標(biāo)志物。

綜上所述，S100A8、S100A9在支氣管哮喘患兒血清中的表達(dá)水平明顯升高，其水平的高低與患者肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%和FEV1%及氣道炎癥因子血清總IgE水平、外周血EOS計(jì)數(shù)相關(guān)，并對(duì)支氣管哮喘疾病有一定的診斷價(jià)值。但本研究納入例數(shù)偏少，結(jié)果可能存在一定偏移，為進(jìn)一步提高研究的精準(zhǔn)性，后期應(yīng)在大量樣本基礎(chǔ)上進(jìn)行深入探究。