糖皮質(zhì)激素抵抗性哮喘患者IL-4、IL-5的基因表達(dá)研究

姜潔 陳穎 李朋玲

支氣管哮喘是我國常見的慢性氣道疾病，目前臨床對于其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述明確，大多認(rèn)為是由多種炎癥細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、肥大細(xì)胞等參與而形成的氣道炎癥疾病[1]。氣道炎癥反應(yīng)是氣道局部浸潤所釋放出的炎癥因子和細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生的，臨床表現(xiàn)為咳嗽、胸悶、氣喘等癥狀，影響患者的生活質(zhì)量。近年來我國支氣管哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢，哮喘的治療和預(yù)防費(fèi)用較高，給患者家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)。糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)有力抗氣道的非特異性炎癥的藥物之一，有吸入、靜脈及口服等給藥方式,，能有效改善肺功能，減輕氣道炎癥反應(yīng)[2-3]。在治療過程中，有少量患者對糖皮質(zhì)激素治療無效果，稱為激素抵抗型(SR)。有研究表明[4]，哮喘病理學(xué)上是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素的增加而導(dǎo)致的，其中白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)是最重要的細(xì)胞因子，能刺激IgE的合成。本研究旨在探討糖皮質(zhì)激素抵抗性哮喘患者IL-4、IL-5基因的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年7月至2018年7月于本院就診的56例哮喘患者作為研究對象，分為SR組28例，SD組28例。同時(shí)選取同期健康體檢人群(正常)組28例。其中SR組男16例，女12例，年齡為41～65歲，平均年齡為(55.26±5.18)歲。SD組男15例，女13例，年齡為42～68歲，平均年齡為(53.89±5.28)歲。對照組男17例，女11例，年齡為40～70歲，平均年齡為(54.10±6.02)歲。三組研究對象一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 三組研究對象的一般資料比較

二、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)近3月內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素治療；(3)本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究人員均簽署知情同意書；(4)SD哮喘患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：為每日口服潑尼松，劑量>10mg且癥狀控制較好；(5)SR哮喘患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：靜脈滴注潑尼松30mg/次，1次/天治療一個(gè)星期后，測定第一秒(FEV1.0)<15%的哮喘患者。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)存在交流障礙者；(2)患有嚴(yán)重先天性肺功能不全、自身免疫性疾病者；(3)近三個(gè)月內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療者、肝腎功能不全者；(4)排除不能接受肺功能檢查者。

三、治療方法

給予SR、SD組患者均給予糖皮質(zhì)激素治療：初期治療給予靜脈滴注潑尼松30mg/次，1次/天，1周后改用布地奈德定量氣霧制劑治療，200μg/次，每天2次。治療時(shí)間為1周，治療期間可按需要使用平喘藥物或短效β2受體阻滯劑，必要時(shí)給予吸氧。每日記錄患者日間及夜間哮喘發(fā)作次數(shù)。

四、觀察指標(biāo)

1 生化指標(biāo)

三組研究對象入院后抽取凌晨空腹靜脈血(5mL)，離心后留取血清，放置在-20℃環(huán)境下檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組研究白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-5(Interleukin-4，IL-5)含量 ，試劑盒由江蘇晶美酶聯(lián)生物有限公司提供，具體操作方法見試劑說明書。

2 PBM-Cs IL-4mRNA、IL-5mRNA的表達(dá)：(1)抽取外周靜脈血5mL分離PBMCs，使用用淋巴細(xì)胞分離液(上海易佰經(jīng)貿(mào)有限公司試劑產(chǎn)品)分離PBMCs。(2)取總RNA：將PBMCs(1×107)個(gè)用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的PBS液洗滌，洗滌三次后移至Eppendorf試管中，置4℃離心血清后，提取RNA。(3)PT-PCR：采用Titan TM One RT-PCR Sys- tem(北京諾博萊德科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)在單一緩沖液中完成。引物序列：IL-4 上游 5′-CTT CCC CCT CTG TTC TTC C-3′, 下游 3′- AAG GAC AGC TCG GCA AAG-5′( 317bp)；IL-5 上游 5′-GAG CCA TGA GGA TGC TTC TGC-3′, 下游 3′-GGT TAC TCT GAG AC T CCT AAG G-5′( 163bp) 。

3 肺功能指標(biāo)

檢測所有研究對象的肺功能，包括第1秒用力呼氣量(FEV1)、哮喘控制評分(ACT)、用力肺活量(FVC)及呼氣流量峰值(PEF)。分值越高，代表肺功能越好。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組入院時(shí)血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較

SR組、SD組患者治療前血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，SR組與SD組患者IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 三組入院時(shí)血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較

二、SR組、SD組治療前后IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較

SR組與SD組患者治療前血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SR組、SD組患者治療后血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平較治療前降低(P<0.05)，且SD組血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平顯著低于SR組(P<0.05)(見表3)。

三、兩組研究對象肺功能相關(guān)指標(biāo)比較

SR組與SD組患者治療前肺功能PEF%、FEV1、FEV1/FVC指標(biāo)水平及PEF評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SR組、SD組患者治療后PEF%、FEV1、FEV1/FVC指標(biāo)水平及PEF評分較治療前上升(P<0.05)，且SR組患者肺功能PEF%、FEV1、FEV1/FVC指標(biāo)水平及PEF評分顯著低于SD組(P<0.05)(見表4)。

表3 SR組、SD組治療后IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平比較

表4 兩組研究對象肺功能相關(guān)指標(biāo)比較

四、兩組患者治療前后臨床療效比較

SR組患者治療前后每周日間哮喘發(fā)作次數(shù)、每周夜間哮喘發(fā)作次數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SD組患者治療后每周日間哮喘、每周夜間哮喘發(fā)作次數(shù)較治療前降低(P<0.05)，且SD組患者治療后哮喘發(fā)作次數(shù)顯著低于SR組(P<0.05)(見表5)。

討 論

哮喘是常見的慢性氣道疾病，其發(fā)病機(jī)制不清楚，哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞成分參與的慢性氣道慢性炎癥，此炎癥會(huì)引起氣道高反應(yīng)性[6]。近年來，我國發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。哮喘主要表現(xiàn)為胸悶、咳嗽、喘息等癥狀。糖皮質(zhì)激素是目前控制氣道慢性炎癥有效的藥物之一，能有效阻斷氣道炎癥反應(yīng)中的環(huán)節(jié)，防止病情發(fā)展，具有較強(qiáng)的免疫抑制和抗炎作用[7-8]。臨床上一部分哮喘患者治療取得較好的療效，SD哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)為每日口服潑尼松，劑量>10mg且癥狀控制較好稱為SD哮喘。但近年來有少數(shù)哮喘患者對治療效果較差，稱為SR哮喘。SR哮喘是指靜脈滴注潑尼松30mg/次，1次/天治療一個(gè)星期后，測定第一秒(FEV1.0)<15%的哮喘患者。同時(shí)吸入β2受體激動(dòng)劑FEV1.0改善>15%，后經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后FEV1.0<15%方可診斷為SR哮喘。對SR哮喘的診斷需符合：(1)足夠的激素量，患者規(guī)范使用激素，確保有足量的激素到達(dá)氣道內(nèi)；(2)生活中無刺激物，無過敏原或致敏物存在；(3)停用β受體激動(dòng)劑；(4)排除潛在的哮喘因素。

表5 兩組患者治療前后臨床療效比較次)

在本研究結(jié)果中，SR組、SD組患者治療前血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，且SR組患者IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平高于SD組(P<0.05)，SR組、SD組患者治療后血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平較治療前降低(P<0.05)，且SD組血清IL-4、IL-5水平及其基因表達(dá)水平顯著低于SR組(P<0.05)，說明哮喘患者通過糖皮質(zhì)激素治療，可有效降低血清IL-4、IL-5水平及基因表達(dá)水平，通過基因轉(zhuǎn)錄水平抑制IL-4、IL-5的表達(dá)而發(fā)揮出哮喘的抗炎作用[15]。本研究結(jié)果表明，SR組、SD組患者治療后PEF%、FEV1、FEV1/FVC指標(biāo)水平及PEF評分較治療前降低(P<0.05)，且SR組患者肺功能PEF%、FEV1、FEV1/FVC指標(biāo)水平及PEF評分顯著低于SD組(P<0.05)，SD組患者治療后每周日間哮喘、每周夜間哮喘發(fā)作次數(shù)較治療前降低(P<0.05)，且SD組患者治療后哮喘發(fā)作次數(shù)顯著低于SR組(P<0.05)，說明糖皮質(zhì)激素可有效減少哮喘患者的發(fā)作次數(shù)，改善患者肺功能。

綜上所述，糖皮質(zhì)激素抵抗性哮喘患者存在IL-5mRNA、IL-4mRNA表達(dá)升高，其抵抗性哮喘者出現(xiàn)抵抗反應(yīng)可能與IL-4mRNA、IL-5mRNA的表達(dá)升高相關(guān)。