PPARγ相關(guān)自噬在急性肺損傷中的作用機(jī)制研究

史婧 關(guān)鍵

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)臨床診斷為急性呼吸窘迫綜合征，主要表現(xiàn)為肺泡及毛細(xì)血管的損傷及引起的肺水腫，是敗血癥和肺炎等疾病最嚴(yán)重的的并發(fā)癥之一，ALI的死亡率仍高達(dá)40%[1]，探究ALI發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。炎癥系統(tǒng)的持續(xù)激活與ALI的進(jìn)展和結(jié)局有著密切的因果關(guān)系，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1的增加和抗炎細(xì)胞因子的降低[2]。ALI與自噬有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)自噬會(huì)緩解炎性反應(yīng)，從而保護(hù)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的肺損傷[3]。并且上調(diào)自噬的水平會(huì)并保護(hù)急性肺損傷[4]，但是關(guān)于ALI相關(guān)自噬的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPARγ)是一種轉(zhuǎn)錄因子，具有促進(jìn)自噬的作用[5]。此外，一項(xiàng)最新的研究結(jié)果顯示PPARγ通路的激活會(huì)抑制炎性反應(yīng)，在ALI中，PPARγ的抑制與炎性反應(yīng)的激活有關(guān)，而激活PPARγ會(huì)抑制炎性因子的表達(dá)[6]。據(jù)此，我們推測PPARγ可能通過調(diào)控自噬抑制炎性反應(yīng)，并可能緩解ALI，本文主要研究PPARγ相關(guān)自噬對(duì)ALI的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

資料與方法

一、動(dòng)物及建模方法

雄性BALB/c小鼠(SPF級(jí)，8周齡)(Laboratory Animal Cecter，中國)。LPS(Sigma公司，美國)。PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮、PPARγ拮抗劑GW9662(Selleck公司，中國)。小鼠TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京樂博公司，中國)。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢華美公司，中國)。倒置顯微鏡(Olympus IX71，Tokyo，Japan)。小動(dòng)物血?dú)夥治鰞xABL90(Radiometer公司，丹麥)。anti-PPARγ、anti-Beclin、anti-LC3、和二抗(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。倒置顯微鏡(Olympus IX71，Tokyo，Japan)。

二、分組及建模方法

將40只小鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、ALI組、ALI+吡格列酮(PPARγ激動(dòng)劑)組和ALI+GW9662(PPARγ抑制劑)組，每組10只。通過呼吸道滴注LPS的方式建立小鼠ALI模型[7]，在建模同時(shí)，LPS干預(yù)6 h前，ALI+吡格列酮組小鼠腹膜內(nèi)注射吡格列酮(10 mg / kg)激活PPARγ通路，ALI+GW9662組小鼠腹膜內(nèi)注射GW9662[1 mg / kg，10%(v/v)DMSO]抑制PPARγ通路，連續(xù)3 d。小鼠進(jìn)行血?dú)夥治龊笫褂迷?%的戊巴比妥(50 mg / kg)麻醉后通過頸脫位法處死小鼠，收集血液和肺組織用于實(shí)驗(yàn)。

三、檢測指標(biāo)

1 血?dú)夥治黾癆LI建模評(píng)估

在建模后通過小動(dòng)物血?dú)夥治鰞x檢測氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]將PaO2/FiO2<300 mmHg定義為建模成功。

2 HE染色檢測肺組織損傷情況

已經(jīng)進(jìn)行血?dú)夥治龊虰ALF采樣后的小鼠處死并取出肺組織，將肺組織固定后包埋在石蠟中。將樣品切成4μm厚的均勻薄片并置于APES涂覆的載玻片上。 使用二甲苯將樣品脫石蠟并水合并用HE試劑染色。加入蘇木精，將樣品在室溫下溫育5min。 洗滌后，加入曙紅，將樣品在室溫下溫育約2min。 在顯微鏡下觀察肺組織損傷情況，并按照參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)出血、肺泡水腫以及浸潤的嚴(yán)重程度評(píng)分，分值為0～4分，分?jǐn)?shù)越高提示肺損傷越嚴(yán)重。

3 ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎性因子水平

將小鼠麻醉后切開氣管，并插入導(dǎo)管，使用0.5 mL的生理鹽水灌洗抽吸3 次，然后將吸出的BALF離心(2 000 rps)10 min取上清液，通過ELISA檢測BALF中TNF-α和IL-1β濃度，按照試劑盒說明書操作。

4 Western blot檢測PPARγ、Beclin和LC3蛋白

在液氮下將肺組織研磨并使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V，120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF膜與anti-PPARγ、anti-Beclin、anti-LC3(1∶500稀釋)在4℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19軟件。 計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，多組之間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性表示為P<0.05。

結(jié) 果

一、各組血?dú)庵笜?biāo)和肺損傷情況比較

ALI組的PaO2/FiO2顯著低于對(duì)照組，而肺組織損傷評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。ALI+吡格列酮組的PaO2/FiO2顯著高于ALI組，而肺組織損傷評(píng)分顯著低于ALI組(P<0.05)。ALI+GW9662組的PaO2/FiO2顯著低于ALI組，而肺組織損傷評(píng)分顯著高于ALI組(P<0.05)。吡格列酮組緩解LPS引起的ALI小鼠模型肺損傷，而GW9662加重肺損傷(見表1、圖1)。

表1 各組小鼠PaO2/FiO2和肺組織損傷評(píng)分比較

二、各組小鼠炎性反應(yīng)的水平比較

ALI組的BALF中TNF-α和IL-1的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的TNF-α和IL-1顯著低于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的TNF-α和IL-1顯著高于ALI組(P<0.05)(見表2)。

圖1 HE染色檢測各組小鼠的肺組織損傷情況(×200)

表2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1的水平比較

三、各組肺組織中自噬相關(guān)蛋白水平

ALI組的肺組織中Beclin和LC3蛋白的水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的Beclin和LC3顯著高于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的Beclin和LC3顯著低于ALI組(P<0.05)(見表3、圖2)。

表3 各組Beclin和LC3水平比較

四、各組肺組織中PPARγ水平比較

ALI組的肺組織中PPARγ蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，ALI+吡格列酮組的PPARγ水平顯著高于ALI組(P<0.05)，ALI+GW9662組的PPARγ水平顯著低于ALI組(P<0.05)(見表4、圖2)。

表4 各組PPARγ水平比較

圖2 Western blot檢測各組肺組織中Beclin、LC3和PPARγ蛋白

討 論

臨床上，ALI一般是由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染和其他因素的彌漫性肺泡炎癥和對(duì)毛細(xì)血管壁的損害，導(dǎo)致肺水腫并最終導(dǎo)致嚴(yán)重的低氧血癥[10]。從組織學(xué)上講，人的ALI的特征是在肺部和中性粒細(xì)胞性肺炎中出現(xiàn)嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)。來自微生物病原體(如LPS等)的免疫炎癥刺激物具有誘導(dǎo)肺部炎癥的能力。目前ALI的臨床治療方法包括保護(hù)性肺通氣治療、俯臥位通氣、高呼氣末正壓通氣和高頻通氣，但這些治療不能有效降低ALI的死亡率，并且患者最終會(huì)遭受肺纖維化，導(dǎo)致永久性肺功能障礙。炎癥反應(yīng)在ALI中發(fā)揮重要作用，但是ALI的炎性機(jī)制涉及細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，其中關(guān)鍵因子和細(xì)胞較多，調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，分析ALI的進(jìn)展機(jī)制對(duì)于診斷和治療ALI具有重要意義。

細(xì)胞自噬是一種常見的進(jìn)程，其主要是將受損的細(xì)胞器或者大分子蛋白包裹進(jìn)入自噬小體，然后遞送進(jìn)入溶酶體分解，將分解的小分子物質(zhì)如氨基酸、核酸等進(jìn)行重新利用[11]。細(xì)胞的自噬可以幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞自身降解，促進(jìn)細(xì)胞在低氧等不利條件下存活，研究顯示當(dāng)Toll樣受體(TLR)相關(guān)的途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)時(shí)，它們可以同時(shí)觸發(fā)細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬對(duì)TLR信號(hào)和炎癥反應(yīng)具有顯著的負(fù)調(diào)節(jié)作用[12]。在ALI中，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了自噬水平的異常，Yang等[13]研究顯示在LPS引起的肺損傷小鼠模型中，自噬水平降低，而提高自噬水會(huì)緩解肺損傷程度。Lei等[14]的研究結(jié)果顯示自噬水平與炎性因子IL-33相關(guān)，提示在ALI中自噬和炎性反應(yīng)具有相互調(diào)節(jié)的作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)自噬的水平會(huì)保護(hù)膿毒癥小鼠的肺損傷[15]。這些均提示了自噬在ALI炎性反應(yīng)和疾病進(jìn)展中的作用，但是具體調(diào)控機(jī)制還不清楚。

PPARγ是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其可通過與其配體結(jié)合和激活，然后與靶基因啟動(dòng)子上游的PPAR反應(yīng)元件相互作用，最終調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)細(xì)胞中的代謝過程[16]。有研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞急性炎性損傷模型中， PPARγ蛋白水平被抑制，并且PPARγ的激活可以抑制炎癥反應(yīng)[17]。He等[18]的研究結(jié)果顯示羅格列酮通過PPARγ/SGK1依賴性信號(hào)通路促進(jìn)ENaC介導(dǎo)的AFC，減輕ALI小鼠模型的肺水腫。這提示了PPARγ在ALI中發(fā)揮抗炎和保護(hù)作用。PPARγ也是調(diào)節(jié)自噬途徑的重要蛋白，而自噬會(huì)抑制炎性反應(yīng)[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)在克羅恩病中，抑制自噬會(huì)促進(jìn)炎性反應(yīng)，從而加重病情[20]。Gao等[21]研究發(fā)現(xiàn)自噬會(huì)通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)緩解炎癥性腸病小鼠模型的癥狀。據(jù)此我們推測在ALI中，PPARγ通路會(huì)促進(jìn)自噬和抑制炎性反應(yīng)緩解肺損傷。在本次研究中，我們分別通過PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮激活PPARγ以及PPARγ拮抗劑GW9662抑制PPARγ，結(jié)果顯示在ALI小鼠模型中，PPARγ通路被抑制，而激活PPARγ通路可促進(jìn)自噬并抑制炎性反應(yīng)，緩解肺損傷提高肺功能，而抑制PPARγ通路會(huì)進(jìn)一步加重ALI小鼠的肺損傷。

綜上所述，在ALI小鼠模型中，PPARγ相關(guān)的自噬會(huì)抑制炎性反應(yīng)，從而減輕肺損傷和提高肺功能。但是關(guān)于PPARγ在ALI中的抑制機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析，并且自噬和炎性反應(yīng)互相調(diào)節(jié)的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。