長(zhǎng)江南京段入江支流底質(zhì)多營(yíng)養(yǎng)級(jí)微生物多樣性研究

曹軍，陳鑫琪，張文龍

(1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210019；2.江蘇省南京環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210013；3.河海大學(xué)，江蘇 南京 210098)

河流底質(zhì)的微生物是河流生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)及水體凈化的驅(qū)動(dòng)力，且微生物對(duì)水環(huán)境變化較為敏感，常被作為指示生物用于監(jiān)測(cè)和反映水質(zhì)情況[1]，例如富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境條件惡化可造成微生物多樣性下降[2]。而水環(huán)境的污染也可造成底質(zhì)微生物群落多樣性降低和導(dǎo)致特定功能菌群產(chǎn)生相應(yīng)變化[3-4]?，F(xiàn)通過(guò)解析長(zhǎng)江南京段入江支流底質(zhì)的不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)微生物群落組成、α及β多樣性，探討平水期和豐水期不同支流的底質(zhì)微生物群落的結(jié)構(gòu)組成差異，以期為長(zhǎng)江南京段入江支流的生態(tài)保護(hù)和環(huán)境監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 研究區(qū)概況

長(zhǎng)江南京段自安徽省東部流入，橫貫?zāi)暇┦?，下接?zhèn)揚(yáng)河段。岸線全長(zhǎng)近200 km，平均水深>15 m，江面寬闊[5]。北岸上起浦口區(qū)駟馬山河口，迄六合大河口，長(zhǎng)約93 km，有駟馬山河、石磧河、高旺河、七里河、京新引水河、石頭河、岳子河、劃子口河、滁河六合段等入江支流。南岸上起江寧區(qū)，迄棲霞大道河口，長(zhǎng)約98 km，有牧龍河、江寧河、工農(nóng)河、板橋河、秦淮新河雨花段、外秦淮河、金川河、北十里長(zhǎng)溝東支、九鄉(xiāng)河、七鄉(xiāng)河、三江河、大道河等支流[6]。

1.2 采樣時(shí)間

結(jié)合流域內(nèi)降水特征及水文節(jié)律特點(diǎn)[7-8]，于2019年平水期(4月)及豐水期(9月)采集底質(zhì)樣品。

1.3 采樣點(diǎn)位

采樣點(diǎn)位分別為：X1B、X2B、X7B、X11B、X13B、X25B、X3A、X6A、X8A、X10A、X12A、X15A—X17A、X19A、X20A，X22A、X24A、X26A—X28A，見(jiàn)圖1。

圖1 采樣點(diǎn)位

1.4 樣品采集

采集的底質(zhì)樣品用無(wú)菌的50 mL聚丙烯管收集，所有的樣品被儲(chǔ)存在干冰盒里，并隨后轉(zhuǎn)移到-80℃的冰箱里保存用于DNA提取。

1.5 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

使用土壤DNA快速提取試劑盒(Fast Soil DNA Kit)快速提取沉積物樣品中的DNA。通過(guò)1% 瓊脂凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)提取的DNA是否質(zhì)量合格。將提取的合格的DNA模板送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，PCR儀為ABI GeneAmp 9700型，擴(kuò)增的具體條件見(jiàn)表1。擴(kuò)增子熒光定量均一化后在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)上進(jìn)行配對(duì)測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件

1.6 生物信息分析流程

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了提升分析序列的質(zhì)量，分析前要先對(duì)測(cè)序產(chǎn)生的原始序列進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。

(1)序列比對(duì)和操作分類單元(OTU)分析：用Flash軟件 (v1.2.7) 對(duì)>75%擴(kuò)增子長(zhǎng)度的Illumina雙端原始讀數(shù)進(jìn)行條形碼和引物裁剪，并進(jìn)行組合。然后使用QIIME v.1.9.1將測(cè)得的序列按照序列相似性為97%的閾值進(jìn)行OTU聚類；

(2)物種分類：使用PyNAST比對(duì)算法與 Silva v128 參考數(shù)據(jù)庫(kù)比較獲得細(xì)菌分類數(shù)據(jù)，與Silva v132參考數(shù)據(jù)庫(kù)比較獲得原生和后生動(dòng)物分類數(shù)據(jù)；

(3)微生物群落多樣性分析：使用PAST3軟件，分析每個(gè)分類單元的相對(duì)豐度分布，從而計(jì)算樣品中的微生物多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 底質(zhì)細(xì)菌群落組成

21條主要入江支流42個(gè)底質(zhì)樣品的優(yōu)化序列數(shù)為61 696，可歸屬于62個(gè)門(mén)，選取平均相對(duì)豐度前10位的菌門(mén)作為優(yōu)勢(shì)門(mén)。平水期入江支流底質(zhì)樣品中的優(yōu)勢(shì)門(mén)包括：變形菌門(mén)(Proteobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)等(圖2a)。其中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)平均相對(duì)豐度最高，占51.56%，綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)各占9.99%、9.19%。豐水期底質(zhì)樣品中的優(yōu)勢(shì)門(mén)包括：變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等(圖2b)。其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)平均相對(duì)豐度最高，占51.98%，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)各占8.67%、8.33%、5.01%。豐水期與平水期相比，底質(zhì)的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)在種類上基本一致；數(shù)量上，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)的相對(duì)豐度分別上升1.29%和2.23%，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和厚壁菌門(mén)(Phylum Firmicutes)各下降3.08%、1.66%和1.15%。

圖2 入江支流底質(zhì)樣品在門(mén)水平上的細(xì)菌群落組成

樣品優(yōu)化序列可歸屬于285個(gè)綱，選取平均相對(duì)豐度前20的菌綱作為優(yōu)勢(shì)綱。平水期入江支流底質(zhì)樣品的優(yōu)勢(shì)綱包括：β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)等(圖3a)。其中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的平均豐度最高，達(dá)到19.08%；γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)次之，平均豐度占14.35%；δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)各占12.13%、5.81%、4.52%，梭菌綱(Clostridia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)各占3.01%、2.99%、2.78%。豐水期底質(zhì)樣品的優(yōu)勢(shì)綱在組成上與平水期一致(圖3b)。而在數(shù)量上存在明顯的水期差異：平水期相對(duì)豐度最高的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的優(yōu)勢(shì)地位在豐水期被δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)所取代，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)相對(duì)豐度下降3.09%；厭氧繩菌綱(Anaerolineae)相對(duì)豐度下降2.50%；硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)相對(duì)豐度上升2.23%。

β-變形菌綱(Betaproteobacteria)包含了固氮細(xì)菌，為沉積物提供了更強(qiáng)的固氮能力，是富營(yíng)養(yǎng)化沉積物的主導(dǎo)微生物，適合生活在較高富營(yíng)養(yǎng)化的水環(huán)境中[9]。硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)具有氨氧化和硝化作用，促進(jìn)氮循環(huán)[10-11]；厭氧繩菌綱(Anaerolineae)屬于兼性厭氧細(xì)菌(anaerobic bacteria)，也具有反硝化功能[12]。因此結(jié)合本研究中不同水期各優(yōu)勢(shì)菌綱的數(shù)量變化可見(jiàn)，豐水期入江支流底質(zhì)環(huán)境的硝化作用可能得到加強(qiáng)，而固氮和反硝化作用有所減弱；且相比平水期的底質(zhì)環(huán)境溶氧較高，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度較低。王毛蘭[13]和魏靜等[14]的相關(guān)研究分別表明豐水期水體的富營(yíng)養(yǎng)化水平和氨氮濃度相較平水期和枯水期較低，與文章分析結(jié)果一致。

圖3 入江支流底質(zhì)樣品在綱水平上的細(xì)菌群落組成

2.2 細(xì)菌群落多樣性

Shannon指數(shù)綜合考慮群落的豐富度和均勻度，其數(shù)值越大，表明群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度和穩(wěn)定性越高，生物多樣性越高[15-16]。而生物多樣性是河流生態(tài)系統(tǒng)平衡和河流系統(tǒng)健康的基礎(chǔ)[17]，常被用作監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)一個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)健康與否的標(biāo)準(zhǔn)[18]。HU等[19]曾比較多種生物指數(shù)和多樣性指數(shù)對(duì)明珠湖水質(zhì)評(píng)價(jià)的結(jié)果，提出采用Shannon指數(shù)能較準(zhǔn)確對(duì)該湖的水質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)采用Shannon指數(shù)表征入江支流底質(zhì)微生物群落的復(fù)雜程度和穩(wěn)定性，以及河流生態(tài)系統(tǒng)健康的程度。見(jiàn)表2。

表2 入江支流底質(zhì)樣品的細(xì)菌、原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的Shannon指數(shù)

由表2可見(jiàn)，平水期細(xì)菌Shannon指數(shù)數(shù)值為5.803～7.608，豐水期Shannon指數(shù)數(shù)值為5.767～7.488，均值分別為6.828和6.899。Shannon指數(shù)明顯較低的點(diǎn)位有X3A(北十里長(zhǎng)溝東支，豐水期)、X20A(石頭河，平水期)、X27A(板橋河，平水期)、X17A(七里河，平水期)等。同時(shí)基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析(NMDS，見(jiàn)圖4)表明，平水期和豐水期的樣品群落組成呈現(xiàn)比較明顯的差異；平水期X2B(金川河)、X20A(石頭河)與豐水期X13B(高旺河)的底質(zhì)樣品細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成與同水期的其他點(diǎn)位差異較大。NMDS結(jié)合置換多元方差分析(ADONIS，p= 0.047 < 0.05)表明入江支流底質(zhì)細(xì)菌群落組成在平水期與豐水期具有差異。底質(zhì)樣品的理化性質(zhì)檢測(cè)分析結(jié)果顯示硝酸鹽氮、總磷(TP)和總有機(jī)碳(TOC)在平水期和豐水期存在顯著差異(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p< 0.05)，而平水期金川河、石頭河的底質(zhì)TOC含量遠(yuǎn)高于其他點(diǎn)位，表明入江支流底質(zhì)環(huán)境在不同水期存在差異。

圖4 不同水期各采樣點(diǎn)底質(zhì)樣品的非度量多維尺度分析(NMDS)

2.3 底質(zhì)原生動(dòng)物和后生動(dòng)物群落組成

選取平均相對(duì)豐度較高的原生動(dòng)物及后生動(dòng)物作為優(yōu)勢(shì)種群，基于Bray-Curtis距離算法對(duì)樣本距離矩陣進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣本層級(jí)聚類樹(shù)與群落結(jié)構(gòu)堆積圖組合形式展現(xiàn)，見(jiàn)圖5(a)(b)。原生動(dòng)物中，不等鞭毛類(Stramenopiles)、囊泡蟲(chóng)類(Alveolata)和綠色植物(Chloroplastida)為主要優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度分別為42.31%，27.96%和16.86%。后生動(dòng)物中，節(jié)肢動(dòng)物(Arthropoda)、輪蟲(chóng)(Rotifera)和線蟲(chóng)(Nematoda)為主要的優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度分別占27.19%，17.56%和14.16%。聚類分析表明，平水期X2B(金川河)、X16A(劃子口河)、X28A(秦淮新河)和豐水期X2B(金川河)、X8A(三江河)、X11B(駟馬山河)與同水期其他點(diǎn)位的相似性很低，相對(duì)獨(dú)立。說(shuō)明這些河流底質(zhì)的原生及后生動(dòng)物群落構(gòu)成與其他河流差異較大。

圖5 入江支流底質(zhì)樣品的原生動(dòng)物及后生動(dòng)物在的群落組成

2.4 原生動(dòng)物和后生動(dòng)物多樣性

底質(zhì)樣品中原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的Shannon指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。21個(gè)采樣點(diǎn)中14個(gè)采樣點(diǎn)的樣品原生動(dòng)物多樣性在豐水期高于平水期，Shannon指數(shù)數(shù)值為0.640～5.308，平水期和豐水期的均值分別為4.046和4.178；平水期和豐水期中分別有X2B(金川河)和X6A(九鄉(xiāng)河)、X17A(七里河)的原生動(dòng)物多樣性顯著低于其他點(diǎn)位，金川河采樣點(diǎn)尤其顯著。另一方面，12個(gè)采樣點(diǎn)的后生動(dòng)物多樣性豐水期高于平水期；Shannon指數(shù)數(shù)值為0.369～2.984，平水期和豐水期的均值分別為2.013和1.906；平水期和豐水期中分別有X17A(七里河)、X11B(駟馬山河)和X25B(牧龍河)的后生動(dòng)物多樣性明顯低于其他點(diǎn)位。

原生及后生動(dòng)物的多樣性往往與污染物濃度呈負(fù)相關(guān)[20]，即水環(huán)境的污染程度越高，原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的多樣性越低。由表2可見(jiàn)，整體上平水期的原生及后生動(dòng)物的多樣性較低，表明平水期入江支流的底質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相對(duì)較差、水體污染程度整體上可能稍嚴(yán)重于豐水期；而金川河、七里河、牧龍河等河流的水污染可能尤為嚴(yán)重。金川河作為南京市重要入江支流且包含省控?cái)嗝?，其流域主要覆蓋老城區(qū)，人口密集[21]，長(zhǎng)期存在水質(zhì)不達(dá)標(biāo)、水環(huán)境惡化等問(wèn)題。雖然近年來(lái)相關(guān)部門(mén)對(duì)入江支流進(jìn)行了水環(huán)境整治，但以上分析表明金川河、七里河、石頭河等入江支流底質(zhì)的多營(yíng)養(yǎng)級(jí)微生物多樣性較低，水生態(tài)系統(tǒng)可能不夠穩(wěn)定。

3 結(jié)論

(1)長(zhǎng)江南京段入江河流底質(zhì)多營(yíng)養(yǎng)級(jí)微生物優(yōu)勢(shì)種與國(guó)內(nèi)其他區(qū)域河流組成類似。細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等，優(yōu)勢(shì)菌綱為β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)等。原生動(dòng)物和后生動(dòng)物中優(yōu)勢(shì)類群分別為不等鞭毛類(Heterknta)、囊泡蟲(chóng)類(Alveolata)和節(jié)肢動(dòng)物(Arthropoda)、輪蟲(chóng)(Rotifera)等。

(2)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)綱中硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)等在相對(duì)豐度上的水期差異顯示豐水期入江支流底質(zhì)環(huán)境相比平水期有較高的硝化作用、溶氧較高而反硝化作用減弱，進(jìn)一步表明豐水期入江支流的富營(yíng)養(yǎng)化水平和氨氮濃度比平水期較低。

(3)細(xì)菌、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物多營(yíng)養(yǎng)級(jí)的群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分析結(jié)果表明，入江支流不同水期的微生物組成存在顯著差異，豐水期的多營(yíng)養(yǎng)級(jí)微生物多樣性整體上高于平水期。