顆粒蛋白前體調(diào)節(jié)Th1和Th17干預(yù)柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)病毒性心肌炎的實驗研究

樊維娜，劉 杲，王阿麗，秦黎明，韓芳琪

病毒性心肌炎主要是由于病毒感染導(dǎo)致的心肌局限性和彌漫性炎癥的病變，在病毒流行感染期間，會有5%的病人患有心肌炎[1]，在臨床上病人的表現(xiàn)不同，主要有發(fā)熱、咽痛、嘔吐、全身酸痛等癥狀[2]，在此癥狀上會伴有呼吸困難、水腫、胸悶、胸痛，以至于阿斯綜合征的發(fā)生[3]，也會有極少數(shù)人出現(xiàn)心源性休克和心力衰竭[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒都會引起心肌炎的發(fā)生，比如人類腸道致細(xì)胞病變的孤兒病毒(ECHO)、脊髓灰質(zhì)炎病毒及柯薩奇病毒A組、B組，柯薩奇病毒B3(CVB3)感染是導(dǎo)致病毒性心肌炎突發(fā)心臟病致使年輕人死亡的主要因素[5]。顆粒蛋白前體(progranulin)是一種多功能的生長因子[6]，能夠調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)體正常組織的發(fā)展、再生、增殖以及在身體防御過程中發(fā)揮著非常重要的作用[7]，顆粒蛋白前體具有對抗腫瘤和各種炎癥的作用[8]。Th1和Th17因子參與CVB3的發(fā)展，Th1和Th17因子都屬于促炎因子[9]，會誘導(dǎo)病毒性心肌炎的發(fā)展，本研究探討顆粒蛋白前體調(diào)節(jié)Th1和Th17對CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與病毒 選取8周左右的雄性大鼠36只，由吉林大學(xué)動物實驗室提供，按要求喂養(yǎng)1周后應(yīng)用于實驗，并隨機(jī)分為空白組、CVB3組、顆粒蛋白前體組，每組12只。CVB3(Nancy株)購自美國ATCC，在Hela細(xì)胞中保存，病毒滴度用50%的組織培養(yǎng)傳染性測定。

1.2 試劑和儀器 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自南京建成生物工程研究所，肌酸激酶活性檢測試劑盒購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ 干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-7(IL-7)試劑盒購自上海蘇彭化，顆粒蛋白前體購自美國Fermentas。高速冰凍離心機(jī)(美國thermo)，石蠟切片機(jī)(Tanon)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海躍進(jìn))。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立 CVB3進(jìn)行擴(kuò)增和繁殖，24 h后從二氧化碳(CO2)保溫箱中去除，3次凍融，1 600 r/min離心30 min，把上清進(jìn)行分裝，保存在冰箱中。24 h后取出并稀釋，把Hela細(xì)胞放入1×105的96孔板中，再將稀釋的CVB3滴到Hela細(xì)胞上面，連續(xù)觀察1周，細(xì)胞病變大于50%的孔為病變孔，并計算CVB3的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。空白組大鼠注射生理鹽水，CVB3組和顆粒蛋白前體組大鼠注射1×103TCID50液體CVB3，7 d后建模成功，觀察3組大鼠的健康狀況和2周的生存情況，2周后對大鼠進(jìn)行麻醉，處死，進(jìn)行血清測定、組織切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.2 心臟超聲檢查 采用意大利百勝M(fèi)yLabTmsix型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為6～19 MHz，對大鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查，檢查前經(jīng)過異氟烷全身麻醉后，再通過超聲心動圖檢測心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。

1.3.3 HE染色 取大鼠心肌組織切片，放入10%多聚甲醛磷酸液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟、包埋，HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測Th1和Th17細(xì)胞占比 將大鼠心肌組織用胰酶消化后，進(jìn)行離心處理，1 000 r/min 離心5 min，用1640培養(yǎng)基加入ACK裂解緩沖液，在37 ℃的環(huán)境下孵育5 min，進(jìn)行離心處理，1 000 r/min 離心6 min，PBS洗滌2次，加入50 μg/mL佛波醇、1 μg/mL離子霉、10 μg/mL布雷非德菌素晃動均勻，在37 ℃的環(huán)境下孵育3 h，加入抗小鼠IL-17A單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，計算Th1和Th17細(xì)胞占比情況。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、IFN-γ、IL-7表達(dá) 加入抗大鼠TNF-α、IFN-γ、IL-7，按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行操作[10]，測量的最小濃度為10 pg/mL，采用680酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠EF、FS比較 心臟超聲檢測結(jié)果顯示，空白組中EF、FS分別為79.25%和51.22%，CVB3組EF、FS分別為59.24%和39.43%，顆粒蛋白前體組EF、FS分別為69.73%和48.89%，CVB3組EF、FS較空白組明顯降低(P<0.05)，證明CVB3對心肌有一定的傷害作用，顆粒蛋白前體組EF、FS較CVB3組明顯升高(P<0.05)，說明顆粒蛋白前體可改善CVB3引起的心臟功能下降，抑制心肌炎的繼續(xù)發(fā)展，對心臟功能損傷具有一定的保護(hù)作用。詳見圖1。

與空白組比較，*P<0.05；與CVB3組比較，# P<0.05。

2.2 心肌組織HE染色結(jié)果 空白組屬于正常心肌組織，細(xì)胞排列整齊，沒有炎癥發(fā)生；CVB3組是建模成功感染CVB3的心肌組織，出現(xiàn)細(xì)胞裂痕增大，心肌壞死、排列混亂、斷裂；顆粒蛋白前體組采用顆粒蛋白前體干擾后，與CVB3組相比，炎性因子浸潤降低，裂痕和壞死病灶逐漸減少，說明顆粒蛋白前體給藥可以有效保護(hù)大鼠免受CVB3感染引起的致死性心肌炎的侵害。詳見圖2。

圖2 心肌組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

2.3 3組Th1和Th17細(xì)胞占比比較 有研究表明Th1和Th17細(xì)胞能夠促進(jìn)CVB3引起的心肌炎的發(fā)展[11]，Th1和Th17細(xì)胞在血清水平CVB3感染中屬于促炎細(xì)胞因子。CVB3組Th1、Th17細(xì)胞占比明顯高于空白組(P<0.05)，顆粒蛋白前體組Th1、Th17細(xì)胞占比明顯低于CVB3組(P<0.05)。說明顆粒蛋白前體可能對CVB3引起的病毒性心肌病有保護(hù)作用，通過調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)心肌炎。詳見表1。

2.4 3組TNF-α、IFN-γ、IL-7表達(dá)比較 CVB3組TNF-α、IFN-γ、IL-7較空白組明顯升高(P<0.05)，顆粒蛋白前體組TNF-α、IFN-γ、IL-7較CVB3組明顯降低(P<0.05)，說明顆粒蛋白前體可以直接抑制TNF-α、IFN-γ、IL-7炎性因子表達(dá)，有效保護(hù)大鼠心肌受損。詳見表2。

表1 3組Th1和Th17細(xì)胞占比比較(±s) 單位：%

表2 3組TNF-α、IFN-γ、IL-7表達(dá)比較(±s) 單位：pg/mL

2.5 3組生存率比較 空白組大鼠生存率為83.33%，CVB3組生存率為28.81%，顆粒蛋白前體組生存率為54.01%，與空白組相比，CVB3組大鼠的生存率明顯降低(P<0.05)，與CVB3組相比，顆粒蛋白前體組大鼠的生存率明顯升高(P<0.05)，說明顆粒蛋白前體調(diào)節(jié)Th1和Th17對CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎具有保護(hù)作用，提高了大鼠的生存率。詳見圖3。

圖3 3組大鼠的生存曲線

3 討 論

CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎目前在臨床上比較常見，嚴(yán)重可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病甚至心力衰竭[11-12]。有研究報道，CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎的存活率達(dá)到70%左右[13]，預(yù)后效果也不理想，不同病人心功能傷害程度不一，心肌炎發(fā)病一般分為兩種不同的方式，第1種是病毒對心肌進(jìn)行直接感染，引起心肌細(xì)胞大量損傷，第2種是病毒感染破壞免疫功能，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[14]，促炎因子增加，導(dǎo)致過激的炎癥反應(yīng)，心肌受損更加嚴(yán)重[15]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，治療心肌炎的方法在臨床上也取得了很大的進(jìn)步，如常規(guī)免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗心力衰竭和心律失常等[16]。本研究觀察顆粒蛋白前體調(diào)節(jié)Th1和Th17對CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎的影響。

本研究結(jié)果還顯示，空白組大鼠EF、FS分別為79.25%和51.22%，CVB3組大鼠EF、FS分別為59.24%和39.43%，顆粒蛋白前體組EF、FS分別為69.73%和48.89%。CVB3組EF、FS較空白組明顯降低，證明CVB3對心肌損傷有一定的傷害作用，顆粒蛋白前體組EF、FS較CVB3組明顯升高，說明顆粒蛋白前體可改善CVB3引起的心臟功能下降，對心臟功能損傷具有一定的保護(hù)作用。心肌組織HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠屬于正常心肌組織，細(xì)胞排列整齊，沒有炎癥發(fā)生，CVB3組大鼠是建模成功感染CVB3的心肌組織，出現(xiàn)細(xì)胞裂痕增大，心肌壞死、排列混亂、斷裂，顆粒蛋白前體組采用顆粒蛋白前體干擾后，與CVB3組相比，炎性因子浸潤降低，裂痕和壞死病灶逐漸減少，說明顆粒蛋白前體給藥可以有效保護(hù)大鼠免受CVB3感染引起的致死性心肌炎的侵害。有研究結(jié)果表明，顆粒蛋白前體是一種新型的分泌生長因子，能夠參與多種疾病的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)[17]。本研究結(jié)果還顯示，CVB3組Th1和Th17細(xì)胞占比明顯高于空白組，顆粒蛋白前體組Th1和Th17細(xì)胞占比明顯低于CVB3組，通過對心肌炎性因子對比分析發(fā)現(xiàn)，CVB3組TNF-α、IFN-γ、IL-7較空白組明顯升高，顆粒蛋白前體組TNF-α、IFN-γ、IL-7較CVB3組明顯降低，說明顆粒蛋白前體對CVB3引起的病毒性心肌病有保護(hù)作用，通過調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)心肌炎和炎性因子的發(fā)生。有研究表明，Th1和Th17細(xì)胞具有明顯的促炎作用，通過顆粒蛋白前體調(diào)節(jié)，可降低炎性因子的發(fā)生，減少心肌受損[18]。

對大鼠的生存率進(jìn)行分析，正常大鼠的生存率為83.33%，被感染CVB3的大鼠生存率為28.81%，采用顆粒蛋白前體干擾被感染CVB3大鼠的生存率為54.01%，提示大鼠生存能力明顯升高，證明顆粒蛋白前體抗炎作用比較明顯。有研究表明，顆粒蛋白前體對抗細(xì)菌性肺炎具有明顯的作用[19]。

綜上所述，顆粒蛋白前體通過抑制Th1和Th17，阻止CVB3誘導(dǎo)的大鼠心肌炎的發(fā)生，表明顆粒蛋白前體可能是一種新的治療心肌炎的方法。