銀杏葉黃酮實(shí)驗(yàn)室提取技術(shù)進(jìn)展

□ 谷政偉 湖南航天天麓新材料檢測有限責(zé)任公司

銀杏（Ginkgo biloba L.）系銀杏科銀杏屬喬木，亦稱白果樹或公孫樹，是古老的中生代孑遺植物，有“活化石”的美稱[1—2]。我國銀杏資源豐富，約占全世界的70%左右[3]，每年秋季有大量的銀杏葉落葉被丟棄或焚燒，造成一定污染。銀杏葉含黃酮、萜類物質(zhì)、生物堿、糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等，其中黃酮是銀杏葉提取物的關(guān)鍵藥效成分之一。黃酮廣泛存在于自然界，具有多種活性，例如抗氧化、抑菌、抗腫瘤和護(hù)肝等，且無明顯副作用，可應(yīng)用于制藥和食品加工等領(lǐng)域[4]。迄今，已有大量關(guān)于銀杏葉黃酮提取的報(bào)道，本文對(duì)近年銀杏葉黃酮的實(shí)驗(yàn)室提取技術(shù)進(jìn)行了綜述和展望，擬為銀杏葉黃酮的進(jìn)一步開發(fā)提供支持與參考。

1 傳統(tǒng)提取方法

1.1 堿液提取

銀杏葉黃酮大多具有酚羥基，呈弱酸性，難溶于酸性水，易溶于堿性水，因此可以利用堿性水溶液或堿性醇溶液提取，之后，對(duì)提取液進(jìn)行酸化，使銀杏葉黃酮形成沉淀析出。黃酮母核的多樣性主要與黃酮骨架、環(huán)系的變化、氧化程度和數(shù)量有關(guān)，在加熱條件下，高濃度堿液可破壞黃酮的母核結(jié)構(gòu)；提取液被酸化時(shí)，為防止生成“佯鹽”，pH 值也不能太低。在已報(bào)道的堿液提取銀杏葉黃酮工藝中，使用較多的堿液有氫氧化鈉—水溶液、氫氧化鈉—乙醇溶液及碳酸鈉—水溶液等，pH 值一般控制在9.0 ～10.0；酸化提取液時(shí)一般使用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH 值。堿液提取銀杏葉黃酮可提高提取得率、縮短提取時(shí)間，且使蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)和含COOH—果膠等形成沉淀而被除去，缺點(diǎn)是提取設(shè)備易被腐蝕。齊建等[5]比較了幾種溶劑對(duì)銀杏葉黃酮提取得率的影響，發(fā)現(xiàn)0.2% NaOH的提取效果優(yōu)于蒸餾水。

1.2 熱水提取

天然黃酮除少數(shù)游離外，大多與糖結(jié)合形成苷，其中黃酮苷易溶于水、乙醇、甲醇等；游離的黃酮即黃酮苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇等有機(jī)溶劑，根據(jù)“相似相溶”原理，熱水提取銀杏葉黃酮得到的主要成分是黃酮苷[6]。閆高穎等[7]用熱水提取銀杏葉黃酮，通過優(yōu)化得到最適工藝：100 ℃條件下提取3 次，每次1 h，料液比為1 ∶26，在此條件下黃酮得率為0.59%。熱水提取銀杏葉黃酮的優(yōu)點(diǎn)是提取溶劑無毒、無味、無污染且可再生，具有提取設(shè)備簡單、成本低和提取液中的脂溶性雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，但熱水提取需要的溫度較高，一般在90 ℃以上，易使銀杏葉黃酮的生物活性受損；提取過程中溶出的蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽及其他一些水溶性雜質(zhì)，導(dǎo)致提取液易腐敗變質(zhì)，加大了后續(xù)分離純化的難度。

1.3 有機(jī)溶劑提取

當(dāng)原料加入到有機(jī)溶劑中時(shí)，有機(jī)溶劑會(huì)進(jìn)入細(xì)胞壁，滲透到細(xì)胞內(nèi)，溶解可溶性物質(zhì)，使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差，直到細(xì)胞內(nèi)外的溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。為減小溶劑揮發(fā)損失和提高提取效率，該技術(shù)一般采用回流加熱裝置，可供選的溶劑有甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮等，其中甲醇和丙酮毒性較大，正丁醇沸點(diǎn)較高且有刺激性，都很少使用，大多使用廉價(jià)、易回收、毒性小的乙醇，并將乙醇與水混溶作為提取溶劑S[8]。乙醇濃度越高，提取溶劑極性越低，色素等脂溶性雜質(zhì)越易溶出，乙醇濃度越小低，提取溶劑極性越大，水溶性雜質(zhì)越易浸出，因此在銀杏葉黃酮的有機(jī)溶劑提取工藝中，乙醇濃度一般控制在50%～85%，李英[9]在乙醇浸提銀杏葉黃酮的工藝中，得到理想條件：4 倍體積（v/w）的濃度為70%的乙醇溶液于60 ℃條件下進(jìn)行6 級(jí)（單級(jí)20 min）逆流浸提。有機(jī)溶劑提取所需溫度一般低于熱水提取，且提取液過濾、溶劑回收和產(chǎn)物干燥等過程易于進(jìn)行，但存在能耗高、污染大、效率低與耗時(shí)長等缺點(diǎn)。

2 新興提取方法

2.1 酶輔助提取

酶輔助提取能提高銀杏葉黃酮提取得率，且反應(yīng)條件溫和、污染小，具有黃酮活性受損小、結(jié)構(gòu)受保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)[10]。該技術(shù)是利用酶降解細(xì)胞壁成分，從而改變細(xì)胞壁通透性，減小銀杏葉黃酮從胞內(nèi)溶出的阻力，以提高提取得率；亦可采用轉(zhuǎn)苷酶和糖等底物將黃酮苷元轉(zhuǎn)換成黃酮苷，以提高黃酮在提取溶劑中的溶解度，促進(jìn)提取的進(jìn)行。植物細(xì)胞壁由纖維素、果膠、半纖維素等組成，在破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)方面，可選擇的酶有纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶及復(fù)合酶等。馮自立等[11]采用復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1 ∶1）提取銀杏葉黃酮，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶用量為銀杏葉的1/300、酶解4.0 h、溫度50 ℃、初始pH 為5.0 時(shí)，酶解效果最佳，該工藝條件下，總黃酮提取率為92.38%。纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶等是蛋白質(zhì)，溫度、pH 值與提取溶劑種類等都會(huì)影響其酶活，條件過高或過低都會(huì)使酶活性受損，在銀杏葉黃酮提取工藝中，提取溫度一般為40 ～50 ℃，pH 值一般為4.5 ～7.0。

2.2 超臨界流體提取

近些年，超臨界流體提取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和石油等領(lǐng)域[12]。在超臨界流體提取銀杏葉黃酮的工藝中，可供選的溶劑較多，如CO2、NO、NH3和C2H6等，其中CO2以不燃、無毒、價(jià)廉且無色，具有易精制、易達(dá)到超臨界條件等優(yōu)點(diǎn)而被普遍使用。CO2是非極性物質(zhì)，純SF—CO2適合提取極性較低的親脂性物質(zhì)或分子量較低的脂肪烴，但銀杏葉黃酮以極性的黃酮苷居多，目前主要通過添加夾帶劑提高銀杏葉黃酮在SF—CO2中的溶解度以提高提取得率，乙醇是常用的夾帶劑，Shi—Feng Miao[13]等采用超臨界CO2提取銀杏葉黃酮，得到最適條件：提取壓力20 MPa、提取溫度40 ℃、夾帶劑乙醇流量6 mL/min、CO2流量10 g/min、提取時(shí)間90 min，在此條件下黃酮得率為0.36%。超臨界CO2提取銀杏葉黃酮所需溫度較低，SF—CO2具有抗氧化和滅菌作用，且溶劑殘留少、污染小，因此有“綠色技術(shù)”的美名；但裝備復(fù)雜，投資大、成本高，導(dǎo)致建立大規(guī)模生產(chǎn)線難度大[14—15]。

2.3 超聲波輔助提取

超聲波是一種頻率高于人類聽覺上限的聲波，它方向性好、穿透力強(qiáng)，常用來提取、清洗、消毒殺菌和碎石等[16]。超聲波輔助提取銀杏葉黃酮是利用超聲波的空化、機(jī)械、熱和化學(xué)效應(yīng)等加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放、擴(kuò)散和溶解，促進(jìn)提取的進(jìn)行。羅教等[17]利用超聲波輔助提取銀杏葉黃酮，通過工藝優(yōu)化，確定在液料比30 ∶1（mL/g）、乙醇濃度70%、提取溫度75 ℃條件下超聲20 min，提取得率可達(dá)2.781%。超聲波輔助提取銀杏葉黃酮操作簡單，設(shè)備維護(hù)和保養(yǎng)方便，具有雜質(zhì)溶出少和低溫節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生噪音，且超聲波能斷開碳—碳鍵，產(chǎn)生活性較強(qiáng)的自由基，破壞黃酮的生物活性及穩(wěn)定性[18]。可供選的超聲波裝置有超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、超聲波發(fā)生器和超聲波清洗器等，大多超聲波清洗器不具有功率調(diào)節(jié)功能，但其成本低、容量大、投料方便，因此在銀杏葉黃酮提取工藝中的應(yīng)用較多。

2.4 微波輔助提取

自1987 年Ganzler 等[19]率先 使用微波技術(shù)分別從蠶豆和棉花中提取嘧啶苷和棉籽酚以來，微波已被廣泛應(yīng)用于黃酮、生物堿、多糖等天然活性物質(zhì)的輔助提取中。傳統(tǒng)熱提取是以熱傳導(dǎo)、熱輻射等途徑從外向里進(jìn)行加熱，這種方法效率低、時(shí)間長；微波輔助提取銀杏葉黃酮主要是利用微波的熱效應(yīng)，微波可瞬間穿透物料，里外同時(shí)受熱進(jìn)行提取，因此該技術(shù)具有較高的黃酮得率且省時(shí)，一般僅需1 ～30 min，這是該技術(shù)最顯著的特點(diǎn)，此外該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有：易控制、選擇性好和節(jié)能等[20—21]。微波輔助提取銀杏葉黃酮的缺點(diǎn)是若微波輻射不均勻，易造成局部溫度過高，致使黃酮活性受損，且設(shè)備泄漏的微波輻射會(huì)對(duì)人體造成慢性損傷。在微波輔助提取銀杏葉黃酮工藝中，影響提取效果的參數(shù)包括溶劑種類、料液比、溶劑濃度、微波時(shí)間、微波溫度與微波功率等，因微波溫度與微波功率這兩者具有較高的相關(guān)性，在實(shí)驗(yàn)中一般只考慮其中一個(gè)因素，且大多只考慮微波功率，徐春明等[22]利用微波輔助提取銀杏葉黃酮，結(jié)果表明：在最優(yōu)條件料液比1 ∶15（g/mL）、乙醇濃度70%、微波功率300 W、微波時(shí)間1 min 下黃酮得率為2.698%。

2.5 其他新興提取技術(shù)

其他新興提取技術(shù)有聯(lián)合提取和微生物發(fā)酵提取等。聯(lián)合提取是指將兩種或兩種以上的輔助技術(shù)同時(shí)先后應(yīng)用于提取中，輔助技術(shù)有超聲波—微波、超聲波—酶、微波—酶和等，提取溶劑可以是水、堿液和乙醇等。微生物發(fā)酵提取銀杏葉黃酮是利用微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的復(fù)合酶系分解細(xì)胞壁中的大分子，如纖維素、半纖維素和果膠等，促進(jìn)目標(biāo)組分從細(xì)胞內(nèi)溶出；該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是成本較低，且實(shí)驗(yàn)條件溫和，但周期較長，一般需要幾天的時(shí)間，且培養(yǎng)基、菌體和代謝產(chǎn)物的存在給銀杏葉黃酮粗提液的分離純化帶來困難。

3 展望

在銀杏黃酮提取新工藝的開發(fā)中，可以從輔助技術(shù)和提取溶劑兩方面下手；在考慮提高提取得率和保護(hù)黃酮生物活性的同時(shí)，應(yīng)結(jié)合提取工藝的成本、安全性、穩(wěn)定性、試劑回收方法以及提取渣的處理方式等。并積極開發(fā)提高原料利用率的措施，例如將提取渣作為提取其他有效成分的原料或經(jīng)過處理使之變成飼料或肥料。

目前，銀杏葉黃酮的提取工藝大多僅以黃酮得率為考察指標(biāo)，但銀杏葉除含有黃酮外，還有萜類、多糖和生物堿等，在資源日漸匱乏的情況下，有必要加強(qiáng)對(duì)銀杏葉中活性物質(zhì)的綜合提取研究。銀杏葉黃酮粗提液中有大量雜質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)和色素等，需純化才能被更好地應(yīng)用，如能將純度納入評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以減輕后續(xù)分離純化工藝的負(fù)擔(dān)。

樹齡、性別、季節(jié)、光照、產(chǎn)地、海拔、溫度和降雨量等因素會(huì)對(duì)銀杏葉黃酮含量、成分和功效等產(chǎn)生影響，吳雅瓊等[23]對(duì)不同產(chǎn)地銀杏黃酮及相關(guān)活性物質(zhì)含量情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)來自漢中的銀杏葉中黃酮含量最高。都勻產(chǎn)地黃酮含量的變異系數(shù)最大，在產(chǎn)地間選擇的同時(shí)也需要關(guān)注產(chǎn)地內(nèi)的選擇。

銀杏樹生長緩慢，自然條件下從栽種到結(jié)果要20 多年，大量結(jié)果則要更久，因此得名“公孫樹”。植物組織培養(yǎng)省時(shí)、占地少，可獲得無毒苗，不受季節(jié)限制，且具有繁殖方式多和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，利用銀杏組織培養(yǎng)技術(shù)為銀杏葉黃酮的提取提供優(yōu)質(zhì)原料是一個(gè)值得探討的課題。