宏蛋白質組學在酒曲酶學及蛋白組成功能研究中的應用

□ 左乾程 貴州大學釀酒與食品工程學院

中國酒曲歷史悠久，其獨特的制作技術可追溯到四五千年前，是世界上最早保存釀酒微生物及其代謝產(chǎn)物的技術。酒曲的發(fā)明，是我國古代人民對世界的重要貢獻，被稱作中國“第五大發(fā)明”。中國酒曲種類豐富，包括釀造白酒的大曲、小曲和麩曲以及釀造黃酒的麥曲等。酒曲既是糖化發(fā)酵劑，又是釀酒原料，同時也能為酒體提供風味物質和生香前體物質[1]，對酒中的香氣和風味物質具有重要貢獻，可以說，在一定程度上，酒曲的質量決定了酒的質量。中國酒曲多采用生料制曲，經(jīng)自然接種，多菌種混合發(fā)酵而成，這樣做有利于保存原料中的豐富酶系，同時，在制曲過程中，豐富的微生物種群產(chǎn)生了大量的酶類及其他風味物質前體物，這些酶蛋白和風味物質前提物，是實現(xiàn)酒曲功能及構成酒體香氣風味的生物化學基礎[2]。了解曲中酶和蛋白的組成及功能，對探究酒中風味物質的產(chǎn)生機理及提升酒體風味品質具有重要作用，要研究酒曲的功能，解釋其發(fā)酵過程的釀造機理，就要從總體上對酒曲的蛋白質進行研究，即進行宏蛋白組學研究。

1 宏蛋白質組學及研究方法

1994年，Wilkins和Williams首次提出了蛋白質組學的概念，它是指細胞、組織或機體所表達的全部蛋白質。蛋白質組學應用范圍較廣，例如詮釋基因組、研究蛋白質的表達及功能，以及蛋白質-蛋白質相互作用等[3]。然而蛋白組學的研究對象一般為純培養(yǎng)微生物的代謝物、單一細胞或組織[3]。對組成復雜、含有大量未能培養(yǎng)微生物的樣品，如酒曲等，蛋白組學的研究就不是很適用。因此，采用宏蛋白質組學對組成復雜的物質的所有蛋白質進行研究就顯得非常重要。

宏蛋白質組學的技術流程主要包括：樣品（蛋白質）的制備，蛋白分離以及蛋白鑒定。

1.1 樣品制備

在酒曲宏蛋白質組學研究中，樣品的制備即為酒曲中總蛋白質的提取，這是酒曲宏蛋白組學技術研究的關鍵及前提，蛋白樣品制備的優(yōu)劣往往決定著后續(xù)研究的成敗。由于酒曲中微生物菌群組成復雜、差異較大，且酒曲中存在有一定數(shù)量的低豐度功能蛋白需要純化，目前還沒有一種提取酒曲宏蛋白的通用方法，因此，在具體的研究過程中，需要根據(jù)研究對象的性質及特點，選擇合適的方法對酒曲中的總蛋白進行提取。

1.2 蛋白分離

宏蛋白組學研究中常用的蛋白分離方法有兩種：雙向凝膠電泳及色譜技術。雙向凝膠電泳-質譜技術是一種應用較為廣泛的經(jīng)典方法[4]，該方法具備能夠對復雜蛋白質混合對象實現(xiàn)鑒定及定量分析的特點，美中不足的是這種技術在分離一些低豐度、疏水性蛋白時，效果不佳。近年來，色譜分離技術及質譜聯(lián)用技術不斷發(fā)展，其在蛋白質組學研究中的應用逐漸廣泛起來，色譜技術的分辨率和直觀性雖然不能與雙向凝膠電泳-質譜技術相媲美，但其分離效果卻是雙向凝膠電泳-質譜技術望塵莫及的，能夠獲得更加精確的蛋白質信息，色譜技術將會在宏蛋白質組學的研究中得到較為廣泛的應用[5]。

1.3 蛋白鑒定

目前，鑒定研究對象中的蛋白質常采用質譜法，常用的有串聯(lián)質譜（MS/MS）法、基質輔助激光解析時間-飛行質譜（MALDI-TOF/MS）以及四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜（QTOF-MS）。除此之外，蛋白數(shù)據(jù)庫的選擇也很關鍵，要通過了解樣品的特性來進行數(shù)據(jù)庫的選擇，樣品中蛋白質與數(shù)據(jù)庫中蛋白的相似性越高，代表蛋白質鑒定的準確性也就越高。對于樣品中未培養(yǎng)的微生物，由于沒有對應的蛋白信息，使得蛋白的鑒定存在很大的困難，因此，迫切需要完善宏蛋白質組數(shù)據(jù)庫來進行蛋白鑒定。

2 基于宏蛋白組學技術的中國酒曲研究進展

近年來，隨著宏蛋白組技術的不斷發(fā)展，其越來越多的被應用到了酒曲酶學及蛋白組成功能的研究中，包括了醬香高溫大曲、清香中溫大曲以及黃酒麥曲的宏蛋白組學研究。了解酒曲中酶和蛋白的組成及功能，對探究酒中風味物質的產(chǎn)生機理及提升其風味品質具有重要作用。

2.1 宏蛋白質組學在醬香高溫大曲研究中的應用

宏蛋白質組學在高溫大曲研究中的應用主要包括分析比較不同大曲宏蛋白組組成成分的差異、不同發(fā)酵條件下大曲微生物分泌胞外蛋白酶的差異，黃永光等[6]對高溫大曲中Aspergillus hennebergii菌株在固、液兩種狀態(tài)下生長時的胞外蛋白組進行了比較研究。結果表明固態(tài)發(fā)酵條件下，Aspergillus hennebergii菌株代謝產(chǎn)生的糖化酶及蛋白酶酶活高于液態(tài)發(fā)酵條件下的酶活。表明Aspergillus hennebergii菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下能夠分泌更多的蛋白酶和糖化酶，從而使白酒的發(fā)酵更為順利，能夠產(chǎn)生更多的風味物質。

2.2 宏蛋白質組學在清香中溫大曲研究中的應用

目前，宏蛋白質組學主要應用于確定清香中溫大曲中酶的微生物來源，為確定清香白酒發(fā)酵的功能微生物提供可靠信息。張秀紅等[7]對清香白酒釀造使用的3種中高溫大曲進行蛋白組學研究，發(fā)現(xiàn)大曲中檢測到的糖化酶均來自于米根霉，由此認為米根霉為清香白酒大曲中產(chǎn)糖化酶的功能菌。

2.3 宏蛋白質組學在黃酒麥曲研究中的應用

宏蛋白質組學在黃酒麥研究中的應用主要是研究制曲過程中宏蛋白質組的變化情況，進而理解麥曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)機理，以對酒曲質量進行監(jiān)控。管政兵等[8]對紹興黃酒麥曲制曲過程中的6個不同時期（起始期、發(fā)酵前期、升溫期、高溫期、降溫期與成熟期）進行了蛋白組學研究，雙向電泳實驗結果表明，麥曲發(fā)酵過程中12個蛋白點發(fā)生了明顯的動態(tài)變化。

3 結論與展望

雖然目前宏蛋白組學技術在中國酒曲研究中的應用不多，但蛋白質才是生命活動的主要體現(xiàn)者，釀酒微生物也不例外，因此要研究中國酒曲中微生物與代謝蛋白的功能及其相互關系，宏蛋白組學是較為有效的方法。隨著蛋白組學及其相關技術的不斷發(fā)展，宏蛋白組學將會被越來越多的應用到酒曲研究中。利用宏蛋白組學，可建立酒曲宏蛋白質組的雙向電泳標準圖譜，并將其應用于實際生產(chǎn)實踐，指導生產(chǎn)實踐，構建以多酶體系為導向的釀造微化物優(yōu)化組合，制備優(yōu)質酒曲，并以酒曲的宏蛋白質組雙向電泳標準圖譜，判斷酒曲品質和生產(chǎn)過程的質量穩(wěn)定性。