千里光石油醚提取物對LPS激活的炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)

楊卉卉，沈金花，劉慶華，彭勇波

中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074

炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵御外界刺激的一種重要防御機(jī)制，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)對機(jī)體有保護(hù)作用，但過度的炎癥反應(yīng)可引發(fā)級聯(lián)放大效應(yīng)并造成全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)甚至危及患者的生命[1]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體病理性炎癥過程的主要免疫細(xì)胞之一[2]，其異常激活能通過響應(yīng)炎癥應(yīng)答信號，產(chǎn)生大量炎性因子并引發(fā)炎癥介質(zhì)的級聯(lián)釋放，從而誘導(dǎo)組織損傷，甚至多功能器官的衰竭等[3]。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答對抗炎及炎性相關(guān)疾病的治療具有重要意義。目前，針對炎癥主要采用抗生素治療，但抗生素的長期使用會產(chǎn)生抗藥性、降低機(jī)體免疫力并加重肝腎損傷等。因此，從天然中草藥中篩選具有顯著抗炎效果、安全無毒并且價(jià)格低廉的藥物已經(jīng)成為當(dāng)前動物養(yǎng)殖中開發(fā)抗生素替代藥物的熱點(diǎn)方向之一。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.)為菊科千里光屬多年生草本植物，在我國西藏、陜西及南方多省均有廣泛分布，是我國常用的一味傳統(tǒng)中藥材，臨床上多用于急性炎性疾病的治療。對千里光現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要含有鞣質(zhì)、黃酮、酚酸、揮發(fā)油、生物堿及萜類等生物活性成分，并主要具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌及抗病毒等多種藥理學(xué)作用[4-5]。

近年來,千里光因其廣泛的藥用價(jià)值而得到越來越多學(xué)者的關(guān)注[4,6]，但目前有關(guān)千里光對巨噬細(xì)胞炎癥調(diào)控作用及機(jī)制的研究還未見報(bào)道。鑒于千里光具有抗炎作用及能治療多種炎癥性疾病的特性，本研究以千里光石油醚提取物(petroleum ether extract ofSenecioscandens，PEESS)為材料，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖、Griess法檢測NO含量、RT-PCR法及Western blot法檢測炎癥相關(guān)因子表達(dá)，綜合探討了千里光的抗炎作用及可能的分子機(jī)制，旨在為將其用于動物炎癥性疾病的治療及替代動物養(yǎng)殖中抗生素的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

千里光干燥全草購于北京同仁堂武漢藥店，產(chǎn)地：湖北。稱取經(jīng)粉碎的千里光細(xì)粉500 g，10倍水3次加熱回流煎煮后合并濾液并旋蒸濃縮，再經(jīng)石油醚萃取后旋蒸濃縮提取獲得千里光石油醚提取物(浸膏狀)并用PBS配制為10 mg/mL的儲存液低溫保存?zhèn)溆谩Ｐ∈髥魏司奘杉?xì)胞系RAW264.7購于武漢CCTCC細(xì)胞庫。

1.2 主要藥物及試劑

胎牛血清(ScienCell，美國)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；脂多糖(Sigma，美國)；CCK-8試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液、總NO檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、化學(xué)發(fā)光顯影液ECL Plus(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶抑制劑Cocktail(Bimake，美國)；NF-κB p65、MAPK p44/p22及其磷酸化抗體、β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國)；2×PfuPCR Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

將生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于12孔板，每孔加1 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即對照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、LPS組(1 μg/mL的LPS+細(xì)胞)、試驗(yàn)組(PEESS+1 μg/mL LPS+細(xì)胞)，每組5個(gè)重復(fù)，PEESS預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞質(zhì)量濃度分別為20、40、80 μg/mL，處理20 h后，添加終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞。

1.4 CCK-8法檢測PEESS對RAW264.7的細(xì)胞毒性

制備單細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/mL),100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h，再用不同質(zhì)量濃度的PEESS(20、40和80 μg/mL)處理細(xì)胞，24 h后向每個(gè)孔中添加10% CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm處測量每個(gè)孔中細(xì)胞的OD值。細(xì)胞活性=(OD加藥- OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.5 Griess法檢測細(xì)胞NO的分泌

制備單細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)，100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h。分組處理細(xì)胞后，取細(xì)胞上清液50 μL/孔按NO檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)流程操作，然后在540 nm處測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到細(xì)胞分泌的NO含量。

1.6 RT-PCR法檢測炎癥相關(guān)基因表達(dá)

獲得細(xì)胞后，用Trizol裂解提取RNA，再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以β-actin為內(nèi)參，目的基因?yàn)镮L-1β和IL-6。其中，引物序列：IL-1β上游5′-TCTGTCATTCGCTCCCCACAT-3′,下游5′-AGAGAGCACACCAGTCCAAA-3′；IL-6上游5′-TCCAGAAACCGCTATGAAGTTC-3′，下游5′-CACCAGCATCAGTCCCAAGA-3′。

1.7 Western blot法檢測細(xì)胞NF-κB及MAPK通路表達(dá)

用含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解RAW264.7細(xì)胞，每隔15 min振蕩1次，共4次。然后在4 ℃和12 000 r/min下離心15 min。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定所得蛋白質(zhì)的濃度。隨后，進(jìn)行電泳，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封閉溶液中封閉1 h，然后在4 ℃與一抗(1∶1 000)孵育過夜。之后，將膜與二抗(1∶4 000)在25 ℃孵育1 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白質(zhì)水平，并使用Image J凝膠分析軟件對蛋白條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。采用2-ΔΔCt公式計(jì)算RT-PCR結(jié)果。使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 6.0處理數(shù)據(jù)和繪圖，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEESS對RAW264.7細(xì)胞生長的影響

為排除PEESS細(xì)胞毒性對細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，分別用終質(zhì)量濃度為20、40、80 μg/mL 的PEESS處理細(xì)胞，24 h后使用CCK-8測定法測定PEESS對RAW264.7細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示，利用0～80 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的PEESS處理RAW264.7細(xì)胞時(shí)，與正常對照組相比，細(xì)胞生長無明顯變化(圖1)，這表明0～80 μg/mL質(zhì)量濃度可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PEESS對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

通過測定細(xì)胞NO分泌量檢測PEESS對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控作用，結(jié)果如圖2所示，與無LPS刺激的空白對照組相比，LPS刺激RAW264.7可顯著提升NO的分泌水平(P<0.01)；而與LPS處理組相比，不同濃度的PEESS則能顯著抑制NO的分泌，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性(P<0.01)。

圖1 PEESS處理后RAW264.7細(xì)胞活性

##代表與對照組比較，P<0.01；**代表與LPS刺激組比較，P<0.01。 下同。## means comparing with control,P<0.01；** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.The same as below.

2.3 PEESS對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

采用RT-PCR檢測炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖3和圖4所示，與無LPS刺激對照組比較，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h能顯著提高炎性因子IL-1β和IL-6的表達(dá) (P<0.01)；而與LPS組比較，20、40、80 μg/mL的PEESS則能顯著抑制LPS刺激的上述2種炎癥因子的表達(dá)，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(P<0.05)。表明PEESS具有較好的體外抗炎特性，其抗炎機(jī)制很可能與其抑制炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

2.4 PEESS對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB、MAPK途徑的影響

NF-κB、MAPK信號通路是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控信號通路，為了進(jìn)一步證實(shí)PEESS可能的抗炎機(jī)制，采用Western blot法檢測PEESS對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65和MAPK p44/42蛋白表達(dá)及磷酸化水平，結(jié)果如圖5所示，LPS處理細(xì)胞24 h能顯著提高p65和p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)；而與LPS組比較，PEESS則顯著下調(diào)了p65與p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，并對p44/42蛋白的磷酸化水平的抑制作用呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。上述結(jié)果說明PEESS可抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NF-κB、MAPK通路的活化，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖3 PEESS處理后RAW264.7細(xì)胞炎癥

##代表與對照比較，P<0.01；*代表與LPS組比較，P<0.05；**代表與LPS組比較，P<0.01。 ## means comparing with control,P<0.01；* means comparing with LPS treated-group,P<0.05； ** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.

圖5 PEESS處理后RAW264.7細(xì)胞炎癥模型NF-κB和MAPK通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的變化

3 討 論

傳統(tǒng)用藥和臨床上，千里光可用于治療眼部感染、風(fēng)寒發(fā)熱、尿路感染、滴蟲性陰道炎及蕁麻疹等[6]，提示其具有良好的抗炎作用。為進(jìn)一步探討博達(dá)的千里光抗炎作用及潛在的機(jī)制，本研究在千里光石油醚部提取基礎(chǔ)上，以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型為材料，檢測了千里光石油醚提取物的體外抗炎作用和抗炎機(jī)制。

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的一道重要防線，在炎癥發(fā)生過程中至關(guān)重要[7]。LPS 刺激小鼠來源的巨噬細(xì)胞RAW264.7 可誘導(dǎo)和激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，釋放NO這一重要的炎癥介質(zhì)，并分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等在內(nèi)的促炎因子，從而誘發(fā)細(xì)胞損傷，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8]。在本研究中，與單純LPS刺激組細(xì)胞比較，添加PEESS能顯著抑制NO的分泌及炎性因子IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，這不僅表明PEESS可能通過降低炎癥介質(zhì)釋放和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)從而發(fā)揮體外抗炎作用，也與千里光對炎癥性疾病具有較好的治療作用的報(bào)道一致[6]。同時(shí)，我們也通過CCK-8檢測其對細(xì)胞增殖毒性的影響排除了千里光提取物的抗炎作用不是依賴于其對RAW264.7 細(xì)胞的毒性效應(yīng)而發(fā)揮影響作用。

在LPS刺激的細(xì)胞炎性應(yīng)答機(jī)制中，LPS通過Toll樣受體家族成員TLR4的介導(dǎo)[9]，激活NF-κB和MAPK信號通路，從而調(diào)控LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的免疫反應(yīng)[10]。為了進(jìn)一步闡明PEESS是否通過影響上述信號通路發(fā)揮抗炎作用，本研究進(jìn)一步檢測了PEESS對NF-κB和MAPK信號通路關(guān)鍵信號蛋白表達(dá)的影響。NF-κB是連接炎癥的關(guān)鍵因子[11]，由p65/RelA、p50、p52、RelB和c-Rel亞基組成，其中p65磷酸化是介導(dǎo)炎癥最關(guān)鍵的一步[12]。另一方面，MAPK信號通路可激活A(yù)P-1轉(zhuǎn)錄因子從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)分泌[13]，在LPS誘導(dǎo)的促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中同樣發(fā)揮重要作用[14]。本研究的結(jié)果表明，PEESS可顯著地抑制NF-κB和MAPK信號通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化水平，從而發(fā)揮抗炎的作用。

綜上，PEESS具有良好的抗炎效應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過抑制促炎信號通路NF-κB和MAPK通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化，從而抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6等的表達(dá)和分泌，但有關(guān)上述信號通路相互之間作用，尤其是千里光中具體抗炎活性成分的鑒定還有待進(jìn)一步的研究。