雌激素受體基因?qū)δ圉q雌雄和倍性生長差異的表達調(diào)控作用

李丹陽,羅麗飛,曹文怡,周小云,高澤霞，2

1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室/長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室， 武漢 430070；2.湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 武漢 430070

在哺乳動物中，17β-雌二醇(17β-Estradiol,17β-E2)可通過雌激素受體在個體發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控攝食行為、調(diào)節(jié)能量平衡的重要作用。有研究表明，將E2注射到小鼠不同的大腦區(qū)域會改變動物的攝食行為和體質(zhì)量[1]。有研究報道卵巢切除的小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、脂肪含量升高的表型，并且這種肥胖表型可以通過體外補充E2來減弱[2-3]。雌激素受體(estrogen receptor,ER)是雌激素發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵所在[4]。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)雌激素受體只有ERα和ERβ2種亞型[5-6]，而在硬骨魚類中普遍存在ERα、ERβ1和ERβ2三種亞型，例如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[9]。ER除可以調(diào)節(jié)性腺生長和分化外，在機體能量代謝方面也發(fā)揮重要作用。在哺乳動物中，ERα基因在調(diào)節(jié)機體能量代謝過程中比ERβ基因發(fā)揮著更為重要的生理功能，例如一些學者研究發(fā)現(xiàn)ERα基因突變體小鼠的體質(zhì)量明顯比正常小鼠大，具有典型的肥胖特征，而ERβ特異缺失的小鼠的體質(zhì)量和正常小鼠沒有顯著差異[10-11]。性別異形現(xiàn)象在魚類中普遍存在，部分魚類雌雄生長速度差異顯著，且表現(xiàn)出物種特異性。此外，魚類多倍體通常表現(xiàn)為比二倍體更快的生長速度[12]。目前，關(guān)于雌激素在魚類中的研究還停留在初步的探索階段，還沒有雌激素受體相關(guān)基因在調(diào)控魚類個體生長速度差異方面的研究報道。

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)是我國重要的小型淡水經(jīng)濟魚類，生長速度快，繁殖能力強，在自然界中普遍存在多倍體現(xiàn)象[12-13]。泥鰍雌性生長速度明顯快于雄性[14]，且四倍體泥鰍的生長速度明顯快于二倍體[15]。本研究克隆泥鰍雌激素受體3個基因ERα、ERβ1、ERβ2的cDNA核心序列，采用qRT-PCR對二倍體泥鰍生長發(fā)育的5個關(guān)鍵時期4種組織以及泥鰍二倍體和四倍體成魚不同組織中ER基因的表達量進行分析，旨在為研究ER調(diào)控魚類雌雄和倍性生長差異的分子機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用泥鰍均為筆者所在實驗室的人工繁殖群體。采集二倍體泥鰍性成熟前后生長發(fā)育階段5個時期(3、6、9、12、18月齡)和18月齡四倍體泥鰍，隨機選取體型正常泥鰍雌雌各6尾，其中二倍體泥鰍各月齡階段雌雄生長差異見圖1；采集的18月齡四倍體泥鰍雌性、雄性平均體質(zhì)量分別為(11.57±5.31) g和(7.35±2.08) g，均顯著高于18月齡二倍體泥鰍雌雄體質(zhì)量(P<0.05)。個體經(jīng)MS-222(100 mg/L)麻醉后，迅速采集腦、肌肉、肝臟和性腺組織，所有樣品液氮速凍后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取。

*表明雌雄間存在顯著差異(P<0.05)；**表明雌雄間存在極顯著差異(P<0.01)。Note: The super “*” means significant difference between females and males (P<0.05); “**” means extremely significant difference between females and males (P<0.01).

1.2 總RNA提取、cDNA合成及檢測

采集的各樣品總RNA利用Trizol(TaKaRa，大連)法按照說明書步驟提取。后續(xù)RNA的純度、完整性檢測以及高質(zhì)量RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法均參考陳宇龍等[16]方法。

1.3 ER基因的克隆及序列分析

將NCBI上下載的斑馬魚ERα、ERβ1和ERβ2基因的cDNA 序列與實驗室前期已獲得的泥鰍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行blast，獲得泥鰍3個目的基因的cDNA片段。 用Primer Premier 5.0軟件針對泥鰍3個基因設計簡并引物，引物由武漢擎科有限公司合成(表1)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，將3個基因合成引物分別進行PCR擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將條帶單一的產(chǎn)物送武漢擎科有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后，將正確的目的基因片段利用Mega 7.0軟件進行拼接。最后將拼接序列與斑馬魚基因序列進行比對以確定編碼區(qū)是否完整。

表1 基因克隆和qRT-PCR分析引物信息 Table 1 Primer sequences for genes clone and qRT-PCR analysis

1.4 泥鰍ER基因理化性質(zhì)分析及進化樹的構(gòu)建

在NCBI的ORF finder 里分析ERα基因開放閱讀框的序列信息(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對ERα基因的分子質(zhì)量及等電點等理化性質(zhì)進行分析；使用DNAman軟件對來自不同物種、不同進化地位的脊椎動物的ERα基因進行氨基酸序列比對，并使用Mega 7.0軟件構(gòu)建ER基因3個亞型的系統(tǒng)進化樹，進行雌激素受體基因3個亞型的聚類分析。

1.5 ER基因表達分析

基于所得到的泥鰍ERα、ERβ1和ERβ2的序列信息，利用Primer Premier 5.0設計其定量引物，由武漢擎科有限公司合成(表1)，以泥鰍β-actin為內(nèi)參基因。使用QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR儀以及SYBR?Premix Ex TaqTM II (TliRNaseH Plus)試劑盒(TAKARA，大連)，分別以二倍體泥鰍不同發(fā)育時期不同組織樣品以及二倍體和四倍體成魚的腦、肌肉、肝臟和性腺組織的cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。用2-ΔΔCt計算出ER基因的3個亞型各自在泥鰍各組織樣品中的相對表達量。通過SPSS軟件中的Duncan’s Multiple Range Test來分析雌激素受體3個基因亞型在二倍體泥鰍性成熟前后5個關(guān)鍵時期的表達情況及二倍體、四倍體相關(guān)組織間的差異表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 泥鰍ER理化性質(zhì)分析

利用同源克隆拼接核心序列，獲得了泥鰍ERα、ERβ1和ERβ2基因的cDNA核心序列，分別為1 821、1 008、1 197 bp。其中ERα基因獲得了完整的CDS序列，ProtParam軟件預測結(jié)果顯示，泥鰍ERα基因由607個氨基酸殘基構(gòu)成，分子式為C2903H4606N840O898S43，分子質(zhì)量為67.02 ku，理論等電點(PI)為8.63，為堿性蛋白。氨基酸殘基中Arg(6.6%)、Gly(7.2%)、Ser(12.4%)、Leu(9.1%)的頻率較高，極性氨基酸占62.4%，非極性氨基酸占37.6%(圖2)。消光系數(shù)(M-1cm-1γ=280 nm)為61 530，不穩(wěn)定系數(shù)為66.06，屬不穩(wěn)定類蛋白；疏水指數(shù)為69.41，平均親水性為-0.45，屬于可溶性蛋白。

圖2 泥鰍ERα基因氨基酸頻率分布圖

2.2 泥鰍ER氨基酸序列比對分析

使用DNAman軟件對人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)等幾個物種3個雌激素受體基因的氨基酸進行同源性分析，并使用 Mega軟件構(gòu)建進化樹。在進化樹中，ERα和ERβ亞型各聚為一類，形成2個大分支(圖3)；在ERβ亞型中，魚類ERβ1和ERβ2各單獨聚為一支，再與其他脊椎動物的ERβ聚在一起；泥鰍ERβ1和ERβ2均與鯉和斑馬魚在進化樹中距離最近。泥鰍ERα蛋白的氨基酸序列與鯉(83.44%)和斑馬魚(85.02%)具有較高的同源性；與其他魚類具有中度同源性(55%～60%)，而與人(46.39%)、鼠(46.83%)、家雞(46.8%)具有低度同源性(圖4)。

2.3 泥鰍ER基因在雌雄生長發(fā)育過程中的表達比較

采用基因熒光定量表達分析方法比較了ERα、ERβ1和ERβ2基因在泥鰍3、6、9、12、18月齡的雌雄個體中的差異表達。結(jié)果顯示，3個基因在泥鰍生長發(fā)育過程中的表達存在一定差異(圖5)。其中在雌性的各個組織中，ERα在腦、肌肉、肝臟和性腺組織中的表達量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖5A、B、C、D)。ERβ1在腦、肌肉和性腺中的表達量整體呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(圖5E、F、H)，而在肝臟組織中的表達量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。ERβ2在腦和肝臟組織中的表達量整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖5I、K)，而在肌肉和性腺組織中整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(圖5J、L)。在雄性的各個組織中，ERα在肝臟和精巢組織中的表達量隨著個體的生長整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖5C、D)；在腦組織中表達量逐漸下降(圖5A)，而在肌肉組織逐漸上升(圖5B)。ERβ1在各個組織中的表達量整體均呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢(圖5E、F、G、H)。ERβ2在腦和肌肉組織中的表達量整體均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(圖5I、J)，而在肝臟和精巢組織中的表達量整體呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(圖5K、L)。在泥鰍雌雄生長發(fā)育過程中，ERβ1和ERβ2在腦組織中的表達模式表現(xiàn)相反，ERβ1整體呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，而ERβ2整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢。此外，ERα和ERβ2在肌肉中的表達模式相反；ERα、ERβ1和ERβ2在雌性肝臟組織中有相同的表達模式，均呈現(xiàn)出先上升后下降的表達趨勢；ERβ1和ERβ2在卵巢中也有相同的表達模式，均呈現(xiàn)出先下降后上升的表達趨勢；ERα基因在雌雄相同組織中的表達比較結(jié)果顯示，ERα在雄性各生長時期的腦組織、肌肉組織和性腺組織中的表達量均顯著高于雌性(P<0.05)(圖5A、B、D)，而在雌性肝臟組織中的表達量顯著高于雄性(圖5C)。ERβ1在各個生長時期精巢組織中的表達量均顯著高于卵巢(圖5H)，而在雌性各個時期肝臟組織中的表達量顯著高于雄性(圖5G)。ERβ2在雄性各個生長時期肌肉和精巢組織的表達量均顯著高于雌性(圖5J、L)，3、6、18月齡雄性腦組織的表達量顯著高于雌性，而在9、12月齡雌性腦組織的表達量顯著高于雄性(圖5I)。

圖3 ERs的系統(tǒng)進化樹分析

a：鯉 Cyprinus carpio； b：斑馬魚 Danio rerio； c：虹鱒 Oncorhynchus mykiss； d：青鳉 Oryzias latipes； e：羅非魚 Oreochromis niloticus； f：人 Homo sapiens； g：鼠 Mus musculus； h：雞 Gallus gallus.

組間標注不同小寫字母表示這些組中雌激素受體基因的表達具有顯著性差異(P<0.05)。Different lowercase letters between groups indicate that the expression of estrogen receptor genes in the groups is significantly different (P<0.05).

2.4 二倍體和四倍體泥鰍ER基因的表達差異分析

泥鰍雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2在泥鰍不同倍性以及不同性別間表達均有差異，如圖6所示：在腦組織中，同一性別的二倍體泥鰍ERα和ERβ2 表達量均顯著高于四倍體(P<0.05)(圖6A和6C)；在同一倍性中，雄性ERα和ERβ2的表達量顯著高于雌性(P<0.05)(圖6A和6C)。雄性二倍體ERβ1的表達量顯著高于四倍體(P<0.05)，二倍體、四倍體雌性間無顯著差異(圖6B)。在肌肉組織中的表達結(jié)果顯示，雄性二倍體ERα的表達量顯著高于四倍體(P<0.05)(圖6D)；雌雄ERβ1和ERβ2在四倍體的表達量均高于二倍體(P<0.05)(圖6E和6F)。在肝臟組織中，雌雄ERα在四倍體的表達量顯著高于二倍體(P<0.05)(圖6G)；在雌性個體中，四倍體ERβ1和ERβ2的表達量均高于二倍體(P<0.05)；在雄性個體中，二倍體ERβ1和ERβ2的表達量均高于四倍體(P<0.05)(圖6H和6I)。在性腺組織中，無論倍性，ERα均在雄性中的表達量顯著高于雌性(P<0.05)(圖6J)；ERβ1在雄性四倍體的表達量顯著高于二倍體的(P<0.05)(圖6K)，雌性倍性間無顯著差別；無論倍性，ERβ2在雄性中的表達量均顯著高于雌性(P<0.05)(圖6L)。

3 討 論

本研究獲得了泥鰍雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2的CDs區(qū)核酸的序列信息，分別采用PCR、基因克隆和測序等技術(shù)，并通過ProtParam進一步分析ERα基因的理化性質(zhì)，可為研究ER基因?qū)δ圉q雌雄和倍性生長差異的表達調(diào)控作用提供理論依據(jù)。對泥鰍ERα基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因的長度和其所編碼的氨基酸數(shù)量與斑馬魚和鯉最相似，相似度在80%～90%。在進化樹中也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，ERα基因與斑馬魚和鯉距離最近，再次驗證了ERα基因與各個物種的親緣關(guān)系。物種親緣關(guān)系的遠近可以由基因的同源性來間接表明。本研究克隆得到的泥鰍ERα、ERβ1和ERβ2 氨基酸序列比對結(jié)果表明泥鰍的3種ERs與鯉和斑馬魚氨基酸序列的一致性高達80%以上，表明ERs在鯉科魚類中高度保守。

本研究中ERα、ERβ1和ERβ2三個基因表達結(jié)果顯示，在二倍體泥鰍不同生長發(fā)育階段，ERα都表現(xiàn)為在雄性的腦、肌肉和性腺組織的表達量顯著高于雌性；倍性間比較結(jié)果顯示，ERα、ERβ1和ERβ2基因在二倍體泥鰍腦組織的表達量均顯著高于四倍體。結(jié)合泥鰍雌雄之間以及二倍體和四倍體的生長特性，結(jié)果表明雌激素受體ERα普遍在生長速度較慢個體的腦組織中高表達。已有報道表明無論是在人類還是其他哺乳動物中，ERα基因在調(diào)節(jié)體質(zhì)量平衡上扮演著重要的角色。例如，Xu等[11]和 Heine等[17]通過基因敲除技術(shù)獲得只在腦組織中特異缺失ERα基因的小鼠，實驗小鼠表現(xiàn)為攝食增多、活動減少，從而導致肥胖。而抑制ERβ則不會出現(xiàn)肥胖表型，此外ERα選擇性激動劑可以有效地抑制攝食，而ERβ選擇性激動劑則不會改變攝食行為[10-11]。由此我們推測腦組織中ERα的高表達可能在一定程度上起到了抑制雄性泥鰍生長的作用。ERβ1和ERβ2在腦組織中的表達模式剛好相反，ERβ1整體呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，而ERβ2整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢，說明這兩個基因可能在腦組織中相互協(xié)調(diào)發(fā)揮一定的生理作用。有研究證據(jù)表明，ERβ在預防飲食引起的肥胖方面起著重要的作用，但ERβ具體的調(diào)節(jié)機制有待進一步研究[18]。ERα在各月齡雄性的肌肉組織中整體呈現(xiàn)出一個逐漸上升的趨勢，而ERβ2整體呈現(xiàn)出一個逐漸下降的趨勢，表明ERα和ERβ2在泥鰍性成熟前后的肌肉組織中相互協(xié)調(diào)發(fā)揮一定的生理作用。ERα和ERβ2在雄性肌肉組織的表達量均顯著高于雌性，這在一定程度上證實了雌激素可以直接抑制肌肉中GHR編碼mRNA的水平的結(jié)論[19]，同時，這也可能是泥鰍雄性的生長速率比雌性低的原因之一。本研究中，ERα基因在雌雄肝臟組織中的表達量均呈現(xiàn)出先上升再逐漸下降的趨勢，且各個月齡雌性的表達量顯著高于雄性。這與海水青鳉[20]和斑馬魚的研究結(jié)果一致[21]。眾所周知，雌二醇通過肝臟合成的卵黃蛋白原釋放到血液再轉(zhuǎn)運到卵母細胞。ERα、ERβ1和ERβ2 基因在精巢的表達量均高于卵巢，這與在斑馬魚[22]和虹鱒[23]中的研究結(jié)果一致，提示ER基因在介導雌激素調(diào)控早期精子的發(fā)生、成熟和排出中發(fā)揮重要的作用。并且ER基因在性腺組織的這種表達規(guī)律在脊椎動物中的保守性較高[24]。

泥鰍雌激素受體基因3個亞型(ERα、ERβ1和ERβ2)在不同組織間表達豐度不同，表明其在不同組織可能參與不同的生理功能。在泥鰍生長發(fā)育過程中無論雌雄，ERβ1和ERβ2在腦組織中的表達模式剛好相反，ERβ1整體呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，而ERβ2整體呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢；除此之外，ERα和ERβ2在肌肉中的表達模式剛好相反；ERα、ERβ1和ERβ2在雌性肝臟組織中有相同的表達模式，均呈現(xiàn)出先上升后下降的表達趨勢；ERβ1和ERβ2在卵巢中也有相同的表達模式，均呈現(xiàn)出先下降后上升的表達趨勢。這些研究結(jié)果表明：雌激素受體的各亞型組成一個調(diào)控體系，在魚類生長發(fā)育不同階段各組織器官的生長和新陳代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究通過對泥鰍雌激素受體基因ERs的克隆及同源性分析，發(fā)現(xiàn)ERs在鯉科魚類中具有較高的保守性。泥鰍生長發(fā)育5個關(guān)鍵時期以及在二倍體、四倍體間不同組織的定量表達分析結(jié)果表明腦組織中ERα基因?qū)︳~類個體生長速度可能具有一定的抑制作用。ERα、ERβ1和ERβ2三個基因組成一個復雜的調(diào)控體系，彼此之間相互調(diào)節(jié)，在機體生長發(fā)育中共同發(fā)揮作用。