云南省綠春縣胡椒病害及叢枝菌根真菌的調(diào)查

尼瑪此姆，韓雨庭，唐婕，黃若霞 ，馬煥成，伍建榕，

1.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224；2.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM) 是球菌門真菌侵染植物營養(yǎng)根系形成的一種互惠共生現(xiàn)象，對(duì)修復(fù)污染生境、保持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定與可持續(xù)生產(chǎn)力的作用顯著。同時(shí)對(duì)植物的營養(yǎng)代謝、水分代謝、抗病性、抗逆性和生長發(fā)育等都具有一定的影響[1]。AM的存在可以使植株的根系生長發(fā)達(dá)或增加根系與土壤的接觸面積繼而使植物能更好地獲取營養(yǎng)物質(zhì)或微量礦質(zhì)元素[2]，還可以通過改變土壤的理化性質(zhì)或改變植株根系等來提高植物生物量、促進(jìn)生長從而減輕植物病害的發(fā)生[1,3]。有研究表明，叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)對(duì)由鐮刀菌造成的黃瓜枯萎病具有一定的抑制作用，在溫室農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中表現(xiàn)出一定的生物防治效果[4]。

胡椒(PipernigrumL．)是胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)的多年生常綠藤本香辛植物，作為一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，被稱為是云南省綠春縣騎馬壩的“綠色黃金”。2013年以來，胡椒瘟病在騎馬壩鄉(xiāng)的各個(gè)村落不斷暴發(fā)，椒農(nóng)損失慘重，成為影響當(dāng)?shù)厣鐣?huì)穩(wěn)定的重要因素之一。因而，加強(qiáng)對(duì)胡椒病害的研究，找到發(fā)病原因、有效的治療方法及預(yù)防措施等顯得格外重要。筆者調(diào)查綠春縣胡椒根際土壤中叢枝菌根真菌孢子的密度、豐富度、多樣性指數(shù)及根系侵染率與胡椒病害發(fā)病率及發(fā)病程度的關(guān)系，旨在為開展胡椒病蟲害的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

騎馬壩鄉(xiāng)位于云南省紅河州綠春縣，海拔高度500～2 500 m左右，年平均氣溫20 ℃，年均降雨量2 800 mm，干濕季分明，屬于典型亞熱帶山地季風(fēng)氣候，素有“天然溫室”之稱，是我國少有的適宜胡椒生長的種植區(qū)。此次采集地海拔900～1 000 m，栽培的胡椒品種主要是大葉種，樣地大部分為沙質(zhì)地段，少部分土質(zhì)微黏。

1.2 發(fā)病率及病情指數(shù)調(diào)查

選擇發(fā)病程度不同的4塊樣地，每塊樣地選取50株10年生進(jìn)入豐產(chǎn)期的成年胡椒植株。按照病害5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)胡椒瘟病進(jìn)行調(diào)查，并計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)：

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)共分為5個(gè)等級(jí)：0級(jí)，無病(代表值1)；Ⅰ級(jí)，感病部位占植株的1%～25%(代表值2)；Ⅱ級(jí)，感病部位占植株的26%～50%(代表值3)；Ⅲ級(jí)，感病部位占植株的51%～75%(代表值4)；Ⅳ級(jí)，感病部位占植株的76%～100%(代表值5)。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)胡椒病株數(shù)×該級(jí)代表值)/

(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)

1.3 菌根侵染率檢測(cè)

1)土樣及根樣的采集。在進(jìn)行調(diào)查的4個(gè)樣地中，分別采集不同發(fā)病程度胡椒的根際土樣和根樣，土樣采取根際5～30 cm土層的土壤1 kg左右裝入自封袋中(各土樣均為東西南北方向各取一部分，混勻)，同時(shí)采集該土樣對(duì)應(yīng)胡椒的根系，選取典型有用的標(biāo)本，盡量采取帶根尖的根段及須根，剪成小段裝入離心管中，加入FAA固定液，貼好標(biāo)簽并帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存[5]。

2)根系的染色鏡檢。取出離心管中的根段，自來水清洗3～5次去除表面固定液，用苯胺藍(lán)染色法對(duì)根系進(jìn)行水浴解離、酸化、染色、脫色[1,5]。將脫色后的根段剪成1 cm左右放在載玻片上，蓋上蓋玻片并在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，觀察AMF的侵染情況，拍照記錄并計(jì)算侵染率。

菌根真菌侵染率=∑(0×根段數(shù)+10%×
根段數(shù)+20%×根段數(shù)+……+100%×
根段數(shù))/觀察總根段數(shù)

1.4 AMF孢子密度測(cè)定

從自然風(fēng)干的土樣中稱取20 g(除去一些大雜質(zhì))置于組培瓶中，加水浸泡10～15 h或過夜使土壤松散。利用濕篩沉淀法將篩面的孢子收集于濾紙上，在體視鏡或解剖鏡下計(jì)數(shù)孢子數(shù)，并換算成每個(gè)土樣及每個(gè)樣地的孢子密度[5-6]。

1.5 孢子鑒定

1)形態(tài)學(xué)鑒定。將體視鏡下完成計(jì)數(shù)的孢子，用解剖針或比較細(xì)的挑針挑取到滴有蒸餾水的載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子的顏色、形狀并記錄大小；將孢子輕輕壓破，觀察孢壁的顏色、層數(shù)、厚度等特征，拍照記錄，參照INVAM(http://fungi.invam.wvu.edu/)提供的圖譜并參閱近幾年發(fā)表的新種的描述等，對(duì)篩選出來的孢子進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[5-6]。

2)分子鑒定。用細(xì)挑針在體視鏡下挑取單個(gè)飽滿的AM真菌孢子，記錄其形態(tài)特征，放入裝有滅菌ddH2O的1.5 mL滅菌離心管中，并做好標(biāo)記。用超聲波清洗2～3次，中間要換到新的裝有滅菌ddH2O的離心管中，清洗結(jié)束后采用OMEGA公司的MicroElute Genomic DNA Kit(50)試劑盒提取DNA、再參考龍良鯤等[7]、劉潤進(jìn)等[1]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(巢氏PCR)、電泳，最后送擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過MAARJAM的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

1.6 豐富度及多樣性指數(shù)的計(jì)算

通過計(jì)算AMF孢子的多樣性指數(shù)[H’=-∑PilnPi(Pi=Ni/N)][1]和Margalef豐富度指數(shù)[D=(S-1)/lnN][6]來描述AMF的物種多樣性。其中：Pi為某采樣點(diǎn)種i的孢子數(shù)與該樣點(diǎn)孢子總數(shù)之比；N為孢子的種群數(shù)量；Ni為種i的個(gè)體數(shù)；S為孢子的種類數(shù)。多樣性指數(shù)一般是基于物種的數(shù)量反映群落種類多樣性，群落的復(fù)雜程度隨著生物種類增多而變高，即H’值越大，群落越穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒瘟病的發(fā)病率、病情指數(shù)及AMF侵染率、孢子密度

對(duì)各個(gè)樣地進(jìn)行AMF的侵染率、孢子密度、發(fā)病率及病情指數(shù)的調(diào)查，結(jié)果見表1。4個(gè)樣地的胡椒分別形成了不同程度的菌根共生體，孢子密度也有一定的差異，其中樣地1的菌根侵染率和孢子密度最高，分別為62.5%和11.72個(gè)/g；樣地4的最低，分別為11%和2.475個(gè)/g。菌根侵染率高的樣地孢子密度也較大。菌根侵染率和孢子密度最高的樣地，發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為20%和9；侵染率低的樣地，發(fā)病率和病情指數(shù)最高，分別為80%和53.5。

2.2 AMF種類及鑒定

對(duì)分離出的孢子先進(jìn)行形態(tài)鑒定，將其大致歸類，再通過分子鑒定進(jìn)行匹配，形態(tài)與分子鑒定結(jié)果一致鑒定為同一個(gè)種，結(jié)果如下：

在樣地1的各土樣中，一共分離出5屬8種的AMF的孢子，分別為無梗囊霉屬(Acaulospora) 的3個(gè)種：A.lacunosa(圖1A )、A.rehmii(圖1B )、A.koskei(圖1C);齒盾囊霉屬(Dentiscutata)的2個(gè)種：D.erythropa(圖1 D)、D.rubra(圖1E )；球囊霉屬(Glomus)的G.ambisporum(圖1 F)；隔球囊霉屬(Septoglomus)的S.constrictum(圖1G )、多孢囊霉屬(Diversispora)的D.epigaea(圖1H)。樣地2的土樣中共分離出5屬8種AMF孢子，孢子種類與樣地1 相同。樣地3共分離出4屬4種，分別為A.lacunosa、A.rehmii、D.rubra和D.epigaea。樣地4共分離出4屬5種，分別為D.erythropa、D.rubra、A.rehmii、G.ambisporum、D.epigaea。

表1 胡椒瘟病病害及根際AMF調(diào)查結(jié)果 Table 1 Investigation results of pepper phytophthora root rot disease and rhizosphere AMF

圖1 胡椒根際AM真菌孢子形態(tài)

2.3 多樣性指數(shù)和豐富度與胡椒瘟病的發(fā)病率及病情指數(shù)的關(guān)系

經(jīng)分析，樣地1的豐富度和多樣性指數(shù)最高(表2)。而樣地4的2個(gè)指標(biāo)最低；樣地1 AMF種的豐富度是樣地4的4.87倍，多樣性指數(shù)是樣地4的2.43倍，樣地1較樣地4發(fā)病率降低了60%，病情指數(shù)少了44.5。從表2中也可以發(fā)現(xiàn)孢子豐富度越高，多樣性指數(shù)也越大；反之則越小。

表2 胡椒根部叢枝菌根真菌種的豐富度及多樣性指數(shù) Table 2 The AMF species richness and diversity index in the root of pepper

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

由表3可見，AM菌根侵染率、孢子密度、物種的豐富度與胡椒瘟病的發(fā)病率和病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P值均小于0.05)。即AMF侵染率、孢子密度、豐富度越高，病情指數(shù)越小，發(fā)病率越低。其中多樣性指數(shù)X與發(fā)病率的線性回歸方程為：Y=-0.943X+1.425；多樣性指數(shù)X與病情指數(shù)的線性回歸方程為：Y=-0.908X+1.008。

表3 發(fā)病率、病情指數(shù)與AMF各指標(biāo)之間的相關(guān)性 Table 3 The correlation between indicators of AMF and incidence,disease index

注Note： *：P<0.05.

3 討 論

3.1 AMF孢子密度、豐富度、侵染率與胡椒瘟病的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，植物根系土壤中AMF的存在能在一定程度上減少植物病害的發(fā)生，提高抗病性。這與李麗等[6]、補(bǔ)娟等[8]的結(jié)果一致，病原菌和AMF之間存在此消彼長，AM能減少病原菌的侵染，防控植物真菌病害。接種AMF之所以能減輕病害的發(fā)生可能是由于AMF與植物共生促進(jìn)了土壤中磷素以及其他礦質(zhì)元素活化，從而促進(jìn)植物生長[9]；也可能是AMF的存在參與了一些抗菌物質(zhì)的合成，如木質(zhì)素、一些酚類物質(zhì)等或與病原物競(jìng)爭生態(tài)位和構(gòu)建機(jī)械防御屏障，同時(shí)AMF還可能刺激病程相關(guān)蛋白以及作為一種生物誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)植物對(duì)病害產(chǎn)生抗性[10-11]。

3.2 AMF侵染率與孢子密度的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，AMF侵染率和孢子密度均與胡椒瘟病發(fā)病率和病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，這與李麗等[6]、方燕等[12]的研究結(jié)果相同；而蓋華[13]研究表明，在基質(zhì)滅菌條件下，接種AMF能增加基質(zhì)中的孢子密度以及提高草莓的菌根真菌侵染率，而且兩者之間呈極顯著正相關(guān)。也有人通過研究證明了灌木植物根系土壤中的孢子密度與AMF侵染率呈正相關(guān)性[14]。但也有研究表明植物根際土壤AMF孢子密度和根系侵染率之間無相關(guān)性[15]。這些結(jié)果差異可能與不同采樣點(diǎn)的土壤理化性質(zhì)、樹齡及AMF的發(fā)育階段等有關(guān)，土壤中的部分孢子可能已經(jīng)失去活力或是處于休眠狀態(tài)，以至于不能侵染植株根系。

3.3 AMF多樣性指數(shù)與胡椒瘟病的關(guān)系

AMF多樣性指數(shù)隨著胡椒瘟病病情指數(shù)和發(fā)病率的降低而增長。有研究表明，AMF多樣性與宿主病害發(fā)病率、病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性[6]。相關(guān)性的大小與AMF種類、土壤類型和宿主植物的交互作用等相關(guān)[16-17]。胡椒根系土壤中AMF的孢子密度、豐富度及對(duì)根系的侵染都與胡椒瘟病發(fā)病率和病情指數(shù)具有一定的關(guān)系，叢枝菌根真菌的存在能對(duì)胡椒瘟病的發(fā)生起到一定的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌的侵染與植物病害的發(fā)病率和病情指數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，在一定程度上能提高植物的抗病性，這與Thygesen等[18]的研究結(jié)果一致。菌根真菌提高植物抗病性是一個(gè)復(fù)雜的作用過程，可從侵染位點(diǎn)和營養(yǎng)能源兩個(gè)方面與病原菌競(jìng)爭生態(tài)位，通過抑制病原菌繁殖達(dá)到防控土傳病害的目的[19]。從侵染位點(diǎn)來看，AMF侵染宿主根系形成菌根后，其菌絲會(huì)迅速占據(jù)相應(yīng)的生態(tài)位點(diǎn)，從而減少病原菌的侵染位點(diǎn)并降低其數(shù)量。例如，在沉香根際接種聚生球囊霉(Glomusfasciculatum)，根系侵染位點(diǎn)被AMF占據(jù)，可減輕瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)的侵染，降低植株病情指數(shù)[20]；從營養(yǎng)能源來看，AMF和病原物的生長都依賴宿主植物提供能量和營養(yǎng)，故存在直接競(jìng)爭關(guān)系[21]。本試驗(yàn)只是從其中一個(gè)方面進(jìn)行的解釋，對(duì)于菌根真菌提高植物抗病性的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。