左盼盼,付蘇,彭麗桃,范剛,楊書(shū)珍,李杰
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,武漢 430070
獼猴桃(Actinidiachinensis)又名藤梨、奇異果,因其富含維生素C、維生素E、葉酸等營(yíng)養(yǎng)成分,熱量低,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,味道酸甜可口,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。獼猴桃作為我國(guó)新興的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一,近年來(lái)得到了快速發(fā)展,我國(guó)已經(jīng)成世界上獼猴桃優(yōu)勢(shì)主產(chǎn)國(guó),其產(chǎn)量和種植面積均位居世界第一[2]。但由于獼猴桃果實(shí)皮薄汁多、營(yíng)養(yǎng)豐富,在果實(shí)貯運(yùn)和銷(xiāo)售過(guò)程中極易遭受病原微生物侵染而腐爛變質(zhì),給生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。其中,獼猴桃軟腐病是獼猴桃采后貯運(yùn)和銷(xiāo)售過(guò)程中危害最為嚴(yán)重的真菌病害,在陜西、貴州等主產(chǎn)區(qū)的發(fā)病率高達(dá)20%~50%,嚴(yán)重制約了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。獼猴桃軟腐病菌在幼果期侵染果實(shí)后長(zhǎng)期潛伏在果實(shí)組織中,至成熟期發(fā)病,尤其在貯藏后期、銷(xiāo)售和消費(fèi)過(guò)程中發(fā)病嚴(yán)重。獼猴桃軟腐病的病原菌多屬內(nèi)生菌,很難從果實(shí)外部判斷病害發(fā)生;同時(shí),引起獼猴桃軟腐病的病原菌種類(lèi)多,且病菌類(lèi)型和致病力易受宿主生長(zhǎng)地域、氣候條件和品種抗性等因素影響,發(fā)病情況復(fù)雜,以上因素均為獼猴桃軟腐病的防控帶來(lái)很大困難[4]。但目前有關(guān)獼猴桃軟腐病的病原菌鑒定和病害控制方面的研究報(bào)道相對(duì)較少,且存在一定爭(zhēng)議。因此,研究獼猴桃采后軟腐病的病原菌種類(lèi)及其控制措施對(duì)于獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
精油是從植物中提取的一種次生代謝物質(zhì),具有強(qiáng)烈芳香性的揮發(fā)性油狀混合物,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物精油超過(guò)3 000種,其中約1 340種植物精油具有抗菌活性,是開(kāi)發(fā)新型安全抗菌劑的優(yōu)質(zhì)資源[5]。香芹酚(2-甲基-5-異丙基苯酚)又稱(chēng)香荊芥酚,是香芹、牛至和百里香的主要活性成分,由于安全性好,在美國(guó)已被批準(zhǔn)為“GRAS”類(lèi)別的天然香料[6]。研究發(fā)現(xiàn)香芹酚具有抗癌、抗氧化、抗菌等多種生物活性,不僅對(duì)腸道沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有顯著的抑制效果[7],對(duì)青霉菌、匍莖根霉菌、灰霉菌和曲霉菌也表現(xiàn)出良好的抑菌作用,在食品防腐保鮮領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[8-9],但有關(guān)香芹酚在獼猴桃采后軟腐病的控制效果方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究從發(fā)病獼猴桃果實(shí)中分離、鑒定軟腐病的主要致病菌,并在此基礎(chǔ)上測(cè)定離體條件下和模擬商業(yè)銷(xiāo)售環(huán)境中香芹酚對(duì)獼猴桃軟腐病菌的控制效果,以期為探究獼猴桃采后軟腐病的發(fā)病規(guī)律和綠色防控提供參考。
發(fā)病獼猴桃果實(shí)分別采集于湖北省襄陽(yáng)市谷城縣萬(wàn)豐園獼猴桃基地、陜西周至縣獼猴桃基地及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊超市。用于模擬銷(xiāo)售貯藏實(shí)驗(yàn)的獼猴桃采自周至縣獼猴桃基地,品種為“徐香”。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;2×TaqPCR Master Mix購(gòu)自天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。香芹酚購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;所用其他試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
采用組織分離法[10]對(duì)致病真菌進(jìn)行分離,具體步驟如下:用水清洗獼猴桃病果表面,用滅菌解剖刀切取病健交接處組織,將組織小塊在75%乙醇中浸泡5 s,無(wú)菌水清洗3次,最后接在PDA培養(yǎng)基上,于26 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng),當(dāng)菌落直徑為1 cm時(shí),挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基內(nèi)于26 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng),經(jīng)3~5次劃線分離,直至獲得純病原菌菌落,4 ℃冰箱保存。
根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定:挑選健康、無(wú)損傷的“徐香”獼猴桃果實(shí),用75%乙醇溶液表面消毒,取菌落邊緣的菌餅(直徑為 5 mm),采用針刺法將菌餅接種于傷口處。以接種無(wú)菌的PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照,于26 ℃ 恒溫培養(yǎng),記錄發(fā)病情況并釆用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。發(fā)病后于病斑處再次分離培養(yǎng)病原菌,并與原接種菌株進(jìn)行對(duì)比,形態(tài)學(xué)鑒定一致則確定為該病原菌。
1)形態(tài)學(xué)鑒定。根據(jù)各致病菌株在PDA上的菌落特征、光學(xué)顯微鏡下菌絲形態(tài)、分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤、菌絲隔膜等性狀進(jìn)行初步鑒定。
2)分子生物學(xué)鑒定。參照Edwards等[11]的CTAB法提取菌株DNA。真菌rDNA -ITS區(qū)的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)作為PCR擴(kuò)增引物。引物擴(kuò)增體系為:15 μL 2×TaqPCR Master Mix,1 μL DNA,1 μL 10 mmol/L上游引物與1 μL 10 mmol/L下游引物,12 μL超純水。PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共35個(gè)循環(huán),72 ℃修復(fù)延伸5 min,4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳,電壓120 V,時(shí)間20 min,在凝膠成像分析儀中進(jìn)行拍照檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,由天一輝遠(yuǎn)生物科技(武漢)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,確定菌株的分類(lèi)地位。
采用生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定香芹酚對(duì)獼猴桃軟腐病原真菌的抑制效果。將病原菌孢子接種至PDA 培養(yǎng)基上于26 ℃培養(yǎng)3 d后,于菌落邊緣處用7 mm的打孔器取菌餅,將菌餅反貼于PDA培養(yǎng)基上;然后,在無(wú)菌濾紙片上滴加0、0.29、0.58、0.87、1.16、1.45、1.74 μg香芹酚并反貼于培養(yǎng)皿內(nèi)蓋中央,快速用封口膜將培養(yǎng)皿密封,使香芹酚的終質(zhì)量濃度分別為0、2.9、5.8、8.7、11.6、14.5、17.4 μg/L。以不含香芹酚作為對(duì)照;每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于26 ℃條件下培養(yǎng)72 h后測(cè)定病原菌的菌落直徑。
挑選大小、色澤及成熟度一致且無(wú)機(jī)械損傷的健康徐香獼猴桃果實(shí),將50 μL 58 mg/L香芹酚溶液均勻噴施在包裝紙表面,晾干后包裹獼猴桃果實(shí),然后將獼猴桃置于聚乙烯保鮮袋中,并于模擬常溫貨架環(huán)境(溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為90%)條件下放置。以上每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30個(gè)果實(shí)。放置期間每隔2 d統(tǒng)計(jì)獼猴桃果實(shí)的軟腐病發(fā)病率,并取樣用于品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。果實(shí)硬度使用GY-4型水果硬度計(jì)測(cè)定,可溶性固形物(SSC)含量使用手持測(cè)糖儀測(cè)定,可滴定酸(TA)含量參照文獻(xiàn)[13]的酸堿滴定法測(cè)定。VC含量采用磷鉬酸法測(cè)定,總酚(TP)和總類(lèi)黃酮(TF)分別參考朱仙慕等[14]和陸蓓等[15]的紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。
本研究從50個(gè)不同來(lái)源的獼猴桃軟腐病發(fā)病果實(shí)中分離獲得8種病原菌共96株,依次編號(hào)為MH-1~MH-8,各種類(lèi)病原菌分別檢出23、31、17、10、5、4、4和2株。病原菌的菌落特征和顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示,根據(jù)菌落特征、生長(zhǎng)速率和菌絲孢子形態(tài)等初步鑒定出5種。
圖1 5種病原真菌在PDA培養(yǎng)基上菌落特征(a)、顯微菌絲形態(tài)(b)和孢子形態(tài)(c)觀察
MH-1:菌絲初為白色,培養(yǎng)3 d后從菌落中央漸轉(zhuǎn)為墨綠色,菌落邊緣不整齊,氣生菌絲發(fā)達(dá),7 d后,菌落顏色加深至黑色;菌絲有節(jié)狀隔膜,多核,直徑約3.55~5.69 μm,依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)[16]初步鑒定為葡萄座腔菌(Botrytisdothidea)。
MH-2:菌絲為白色,邊緣較整齊,呈明顯輪狀生長(zhǎng),氣生菌絲不發(fā)達(dá),緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)且生長(zhǎng)速度較慢,5 d后產(chǎn)生菌核;菌絲較細(xì),2.45~3.86 μm,分生孢子器暗褐色、分散、球形或扁球狀、單腔;分生孢子梗分隔、細(xì)長(zhǎng),孢子形狀似麥粒,孢子大小為(2.07~2.88) μm×(6.21~7.89) μm。依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)[17]初步鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsissp.)。
MH-3:菌絲為灰白色絨狀,然后轉(zhuǎn)為淺褐色,菌落邊緣較整齊,氣生菌絲旺盛,3 d后菌落直徑達(dá)
到90 mm,可產(chǎn)生黑色菌核;菌絲有節(jié)狀隔膜,直徑為6.05~8.28 μm,具隔膜,頂端呈 1~2 次分枝,分枝的末端膨大,上密生小梗,小梗上聚生大量分生孢子;孢子為橢圓形,大小為(11.08~13.23) μm×(7.88~9.35) μm,依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)[18]初步鑒定為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。
MH-4:菌落初為白色,從底部逐漸變?yōu)榧t色,邊緣呈放射狀,氣生菌絲為白色且旺盛;菌絲寬度約為3.45~5.52 μm,分生孢子為彎月形或紡錘形,有2~5個(gè)隔膜,大小為(3.59~4.91) μm×(25.45~33.06) μm,依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)[19]初步鑒定為層出鐮刀菌(F.proliferatum)。
MH-5:菌落初為白色,后變?yōu)榛揖G色,3 d后轉(zhuǎn)為墨綠色,氣生菌絲不發(fā)達(dá),邊緣整齊,生長(zhǎng)速度適中;菌絲有橫隔,寬度約為4.27~5.87 μm;分生孢子呈紡錘形、棍棒形或梨形,褐色,大小為(7.21~8.54) μm×(19.02~23.07) μm,依據(jù)上述特征并結(jié)合文獻(xiàn)[17]初步鑒定為鏈格孢菌(Alternariasp.)。
將分離純化的病原菌回接至健康獼猴桃果實(shí),室溫放置7 d后,5株病原菌造傷接種的獼猴桃果實(shí)均出現(xiàn)了明顯的軟腐病病狀,而對(duì)照組的則不發(fā)病(圖2A)。對(duì)發(fā)病組織的病原菌重新分離再培養(yǎng)后,其培養(yǎng)特性和菌絲形態(tài)與原病菌一致。由圖2B可知,MH-1與MH-2兩種病原真菌的病斑直徑最大,分別為(40.37±0.55)和(37.6±3.31) mm,致病性最強(qiáng),而MH-3和MH-4致病性最弱。因此,本研究進(jìn)一步利用ITS基因序列對(duì)MH-1、MH-2進(jìn)行分子鑒定。
以通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到MH-1和MH-2 菌株的rDNA-ITS序列,電泳圖譜顯示2個(gè)菌株的rDNA-ITS序列長(zhǎng)度大小為500~750 bp(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示MH-1、MH-2菌株的rDNA-ITS序列大小分別為552、587 bp,與電泳圖譜結(jié)果一致。將獲得的序列與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)MH-1、MH-2與葡萄座腔菌B.dothidea(KP183175.1)、擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsissp.(KJ739493.1)的同源性均達(dá)到99%。因此,MH-1與MH-2兩種病原菌分別鑒定為葡萄座腔菌(B.dothidea)與擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsissp.)。
圖2 獼猴桃軟腐病病原菌的回接病癥(A)及致病性測(cè)定(B)
圖3 MH-1與MH-2 rDNA-ITS序列瓊脂糖凝膠電泳圖譜
香芹酚對(duì)8種獼猴桃軟腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)的體外抑制效果見(jiàn)表1。由表1可知,香芹酚處理對(duì)8種獼猴桃軟腐病菌均有顯著抑制作用,其中香芹酚對(duì)MH-2和MH-7的抑制效果最強(qiáng),其次是MH-1和MH-6,其相應(yīng)的EC50分別為8.78、10.72、12.15、12.15 μg/L,對(duì)其余4種病原菌的EC50值均在14~26 μg/L。表明香芹酚在離體條件下可以有效抑制獼猴桃軟腐病菌的生長(zhǎng)。
由圖4可以看出,隨著放置時(shí)間延長(zhǎng),處理組和對(duì)照組果實(shí)在模擬銷(xiāo)售條件下的發(fā)病率均逐步增高,但香芹酚處理果實(shí)的軟腐病發(fā)生率始終顯著低于對(duì)照(P<0.05)。在放置2 d時(shí),對(duì)照組獼猴桃果實(shí)開(kāi)始有軟腐病發(fā)生,6 d時(shí)對(duì)照組獼猴桃果實(shí)軟腐病發(fā)病率明顯提高,達(dá)32.22%,而此時(shí)處理組獼猴桃果實(shí)發(fā)病率僅為11.11%;8 d時(shí)對(duì)照組果實(shí)的發(fā)病率為64.44%,而處理組果實(shí)的發(fā)病率為32.22%,僅為對(duì)照的50.17%(圖4)。因此,香芹酚顯著降低模擬銷(xiāo)售條件下獼猴桃果實(shí)軟腐病的發(fā)生。
表1 香芹酚對(duì)8種獼猴桃軟腐病菌的體外抑制作用 Table 1 Inhibition of carvacrol on the eight kiwifruit soft rot pathogens in vitro
圖4 香芹酚對(duì)模擬銷(xiāo)售條件下獼猴桃果實(shí)軟腐病發(fā)病率的影響
為了評(píng)價(jià)香芹酚處理對(duì)獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響,本研究測(cè)定了處理組和對(duì)照組果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸、VC含量、總酚含量、總類(lèi)黃酮含量等相關(guān)品質(zhì)指標(biāo),結(jié)果如表2所示。經(jīng)香芹酚處理的獼猴桃果實(shí)的硬度、TSS、TP及TF與對(duì)照果實(shí)無(wú)顯著差異,而經(jīng)香芹酚處理的獼猴桃果實(shí)VC含量和TA含量顯著高于對(duì)照組果實(shí),表明香芹酚處理對(duì)果實(shí)硬度等無(wú)不良影響且能夠有效保持獼猴桃果實(shí)的采后品質(zhì)。因此,香芹酚處理可使獼猴桃果實(shí)在采后銷(xiāo)售和消費(fèi)期間保持較高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和貯藏品質(zhì)。
表2 香芹酚對(duì)獼猴桃采后品質(zhì)的影響(溫度25 ℃,相對(duì)濕度90%) Table 2 Effect of carvacrol on quality attributes of kiwifruits at 25 ℃ and RH 90%
軟腐病是引起獼猴桃采后腐爛變質(zhì)的重要真菌病害之一,目前在我國(guó)多個(gè)獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,在國(guó)外如日本、新西蘭和意大利等國(guó)也有發(fā)生[20-22]。Li等[10]對(duì)來(lái)自中國(guó)11個(gè)獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的獼猴桃軟腐病病果的病原菌進(jìn)行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌是引起獼猴桃軟腐病的主要致病菌。葡萄座腔菌不僅危害獼猴桃果實(shí)還能使葉片產(chǎn)生斑點(diǎn),損傷枝條,在枝葉表面產(chǎn)生豐富的分生孢子,同時(shí)也引起蘋(píng)果和梨等果實(shí)腐爛[4]。而擬莖點(diǎn)霉屬真菌是一類(lèi)重要的植物病原菌,可引起寄主植物多種病害,如桃枝條潰瘍病、大豆莖萎病、葉斑病和果腐等,同時(shí)也是導(dǎo)致龍眼、芒果、甜瓜和藍(lán)莓等果實(shí)采后腐爛的主要致病菌[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌是引起獼猴桃軟腐病的主要致病菌,在獼猴桃果實(shí)采后軟腐病發(fā)生過(guò)程中起到重要作用,此結(jié)果與前人研究基本一致。值得注意的是,擬莖點(diǎn)霉菌在PDA平板上未觀察到分生孢子,而李誠(chéng)等[24]在顯微觀察擬莖點(diǎn)霉菌和葡萄座腔菌時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)2種病原菌在常規(guī)培養(yǎng)基上不易產(chǎn)生孢子,需通過(guò)近紫外光照射等方法誘導(dǎo)產(chǎn)孢。此外,本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌、層出鐮刀菌和鏈格孢菌也能引起獼猴桃采后軟腐病。吳文能等[17]從“貴長(zhǎng)”獼猴桃軟腐病果中分離出鏈格孢菌,但檢出率較低。陸訓(xùn)等[25]報(bào)道引起湖南省獼猴桃發(fā)生軟腐病的主要致病菌是大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌。Zhou等[4]從四川獼猴桃軟腐果實(shí)中不僅分離出葡萄座腔菌,還分離出焦腐病菌和小新殼梭孢等病原真菌。以上結(jié)果表明引起獼猴桃軟腐病發(fā)生的病原菌種類(lèi)多,發(fā)病規(guī)律復(fù)雜,有必要對(duì)其發(fā)病規(guī)律進(jìn)行更加深入系統(tǒng)的研究。
香芹酚作為牛至精油的主要成分,對(duì)青霉菌、曲霉菌、根霉菌等多種果蔬采后腐敗真菌均有抑制作用[26-27]。Suwanamornlert 等[28]用香芹酚熏蒸和直接接觸處理龍眼果實(shí)采后病原真菌,發(fā)現(xiàn)香芹酚對(duì)4種龍眼采后病原菌的菌絲生長(zhǎng)抑制表現(xiàn)出顯著的抑制作用,其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均僅在40~80 μL/L。Zhang等[29]報(bào)道20 ~ 120 μL/L香芹酚處理可以抑制灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng),菌絲在120 μL/L時(shí)受到完全抑制,且抑制效果呈顯著的劑量效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)香芹酚熏蒸處理對(duì)引起獼猴桃軟腐病的8種病原菌的菌絲生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用,并且對(duì)獼猴桃軟腐病的主要致病菌擬莖點(diǎn)霉菌和葡萄座腔菌的抑菌效果尤其顯著,其EC50值僅為8.78 μg/L和12.15 μg/L。同時(shí),香芹酚對(duì)模擬銷(xiāo)售條件下獼猴桃果實(shí)采后軟腐病具有良好的控制效果,經(jīng)香芹酚處理后果實(shí)病害發(fā)生率僅為對(duì)照果實(shí)的50.17%。Abdollahi等[30]發(fā)現(xiàn)在采后噴灑以香芹酚為主要成分的夏味精油能降低無(wú)籽葡萄的病害發(fā)生率,減少質(zhì)量損失,對(duì)風(fēng)味口感沒(méi)有不良影響;Peretto等[31]報(bào)道含有香芹酚的可食性膜能有效降低草莓果實(shí)采后腐爛,并保持果實(shí)品質(zhì)。此外,香芹酚顯著降低甜櫻桃[32]、柑橘[33]、番茄[34]等果實(shí)采后病害的發(fā)生。以上研究顯示香芹酚在果實(shí)采后病害的控制方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本研究中香芹酚對(duì)8株致病真菌均表現(xiàn)出顯著的抑制作用;同時(shí),有效降低了模擬銷(xiāo)售條件下獼猴桃果實(shí)軟腐病的發(fā)病率,對(duì)獼猴桃采后軟腐病具有良好的控制效果,可以改善獼猴桃果實(shí)品質(zhì),減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失,增強(qiáng)果實(shí)的耐貯性,從而達(dá)到保持獼猴桃果實(shí)食用價(jià)值且延長(zhǎng)貨架期的效果。