蘿卜蚜端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT基因的鑒定與表達(dá)分析

張?chǎng)螡?張慧杰,周義成,李昭,王赫遠(yuǎn),朱智慧

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省昆蟲(chóng)資源利用與害蟲(chóng)可持續(xù)治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

蘿卜蚜Lipaphiserysimi(Kaltenbach)屬半翅目Homoptera蚜科Aphididae昆蟲(chóng)，又稱(chēng)菜縊管蚜，是世界上分布最廣的蚜蟲(chóng)之一。成蟲(chóng)及若蟲(chóng)通過(guò)刺吸植物韌皮部汁液，為害白菜、油菜、蘿卜等十字花科蔬菜[1]，造成受害植株發(fā)育不良、生長(zhǎng)停滯；蜜露易誘發(fā)霉污病，影響植株光合作用。此外，蘿卜蚜還是傳播多種植物病毒的介體昆蟲(chóng)，能夠傳播多種蔬菜病毒病，危害嚴(yán)重[2]。目前，蘿卜蚜防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、害蟲(chóng)抗藥性等問(wèn)題日益嚴(yán)重[3]。因此，探究蘿卜蚜的致害機(jī)制是對(duì)其進(jìn)行防治的重要前提。

端粒(telomere)是一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，在保護(hù)染色體和控制細(xì)胞生長(zhǎng)及壽命等方面具有重要作用，并與細(xì)胞凋亡及永生化等密切相關(guān)[4]。端粒酶(telomerase)是一種核糖核蛋白復(fù)合體，由3個(gè)主要的亞單位構(gòu)成，其中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是具有催化活性的亞單位[5]。在哺乳動(dòng)物等高等真核生物中，只有在干細(xì)胞、生殖細(xì)胞等必須不斷分裂的細(xì)胞中才能夠檢測(cè)到端粒酶的活性；而在正常的體細(xì)胞中，一旦檢測(cè)出活性，則常常伴隨癌癥發(fā)生[6]；但在無(wú)脊椎動(dòng)物的體細(xì)胞中，端粒酶的活性多有報(bào)道。目前，端粒酶在等翅目、鱗翅目、直翅目、膜翅目、毛翅目、鞘翅目等昆蟲(chóng)中均被檢測(cè)到活性，有些種類(lèi)的TERT基因已被克隆[7-9]。本研究選取蘿卜蚜為研究對(duì)象，克隆其TERT基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析，明確TERT基因在蘿卜蚜不同齡期、不同組織的表達(dá)情況，旨在為研究TERT基因在蘿卜蚜中的功能提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1)供試?yán)ハx(chóng)。蘿卜蚜L.erysimi采集于湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)附近的蔬菜地，采集后放置于溫室培養(yǎng)的上海青(金美1號(hào))上。用毛筆尖輕觸待移蘿卜蚜，待其拔出口針后移至新鮮的白菜葉片上。注意適時(shí)更換白菜，保證室內(nèi)蚜蟲(chóng)種群穩(wěn)定，能夠多代繁殖。

2)培養(yǎng)條件。溫度(25±1) ℃，光周期14L∶10D，濕度70%±5%。

3)主要試劑及儀器。智能人工氣候箱，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；RNAiso Plus試劑，TaKaRa公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司；PCR，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，TaKaRa公司；膠回收試劑盒，DNA Gel Extraction Kit，AxyGen公司；qRT-PCR試劑盒，TransStart Tip Green qPCR SuperMix，Trans公司；2×TaqMaster Mix，SimpleBio。

1.2 樣品采集

收集尚未產(chǎn)仔的無(wú)翅蘿卜蚜成蟲(chóng)若干頭置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中放置新鮮白菜，每24 h更換1次白菜，保持濾紙的干凈和濕潤(rùn)。48 h后可得到1齡蘿卜蚜若蟲(chóng)。若蚜共有4個(gè)齡期，每蛻1次皮即為1個(gè)齡期。挑取1～4齡蘿卜蚜若蟲(chóng)各25～30頭，蘿卜蚜成蚜20～25頭置于干凈的1.5 mL無(wú)酶離心管中，放于-80 ℃冰箱中保存，待提取RNA。另取50頭4齡蘿卜蚜若蟲(chóng)于體式顯微鏡下進(jìn)行解剖，將解剖得到的頭部、胸部、腹部分別置于1.5 mL無(wú)酶離心管中，放于-80 ℃冰箱中保存，待提取RNA。

1.3 蘿卜蚜總RNA提取(Trizol法)

將上述樣品按照RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)方法[10]分別提取蘿卜蚜不同齡期及其不同組織的總RNA，并進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)合格后存于-80 ℃冰箱，保存待用。

1.4 cDNA合成

利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA樣品進(jìn)行DNaseⅠ處理，完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過(guò)程。

1.5 端粒酶TERT基因CDS序列克隆

利用Blast檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索與蘿卜蚜相近物種的同一靶標(biāo)基因蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列。用本地獲得的二代測(cè)序蘿卜蚜轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行比對(duì)查詢(xún)，確定所選基因的序列，進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)靶標(biāo)基因的片段設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表1)，分3段擴(kuò)增TERT基因的CDS區(qū)域。以蘿卜蚜cDNA為模板，根據(jù)2×TaqMaster Mix (SimpleBio) 說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增靶標(biāo)基因。反應(yīng)體系為22 μL ddH2O，25 μL 2×TaqMaster Mix，1 μL cDNA模板，1 μL正向引物(10 mmol/L)，1 μL反向引物(10 mmol/L)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，55～60 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用溶解在0.75×TAE buffer的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接體系轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取正確陽(yáng)性克隆送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并拼接。

1.6 端粒酶TERT基因生物信息學(xué)分析

將克隆得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，與NCBI庫(kù)中的基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，確定端粒酶TERT基因的CDS序列，根據(jù)獲得的序列信息利用蛋白預(yù)測(cè)工具PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)翻譯成氨基酸序列，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用BioEdit軟件將蘿卜蚜TERT基因編碼的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比較，利用MEGA X軟件構(gòu)建蘿卜蚜端粒酶與其他昆蟲(chóng)比對(duì)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TERT表達(dá)量

按照本文“1.2”樣品采集方法，每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。以eIF(登錄號(hào)：MG993328)為內(nèi)參基因，qRT-PCR引物設(shè)計(jì)(表1)根據(jù)線性回歸模型進(jìn)行分析。將cDNA梯度稀釋(1/5、1/25、1/125、1/625、1/3 125)后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，使用擴(kuò)增效果最好的引物作為本研究qRT-PCR引物。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

將cDNA產(chǎn)物稀釋20倍后作為qRT-PCR模板，反應(yīng)按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Trans)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系為5 μL 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix，0.2 μL正向引物(10 mmol/L)，0.2 μL反向引物(10 mmol/L)，2 μL cNDA模板和2.6 μL ddH2O。 qRT-PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[11]進(jìn)行計(jì)算，以分析TERT基因在不同組織、不同齡期的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SnapGene 軟件對(duì)序列的測(cè)序峰圖進(jìn)行人工核對(duì)，利用Blast(NCBI)工具對(duì)DNA序列進(jìn)行同源性分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，利用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較的差異顯著性分析。

表1 PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物 Table 1 PCR,qRT-PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜蚜TERT基因編碼氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)基因克隆、拼接測(cè)序，得知蘿卜蚜TERT基因(Accession number：MN381841)序列長(zhǎng)度為2 658 bp，且其起始密碼子與終止密碼子均包含在序列中即確定為完整的CDS序列。序列分析顯示，該基因能編碼885個(gè)氨基酸(圖1)。將TERT氨基酸序列輸入PSIPRED進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)含41個(gè)α-螺旋和60個(gè)卷曲螺旋(圖2)。

圖1 蘿卜蚜TERT編碼氨基酸序列

紅色(Helix)代表α-螺旋；灰色(Coil)代表卷曲螺旋；綠色(Green)代表氨基酸鏈。Red (Helix) stands for α-helix; Gray (Coil) stands for coiled-coil;Green (Strand) stands for amino acid strand.

2.2 蘿卜蚜端粒酶TERT 基因與其他昆蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將蘿卜蚜端粒酶TERT基因推導(dǎo)出來(lái)的氨基酸序列與NCBI上已公布的其他昆蟲(chóng)的端粒酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。Blast結(jié)果顯示，蘿卜蚜端粒酶序列與其他半翅目昆蟲(chóng)具有較高同源性(圖3)。

利用MEGEX 軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，結(jié)果顯示：蘿卜蚜端粒酶TERT基因與麥雙尾蚜DiuraphisnoxiaTERT基因的關(guān)系最近，與桃蚜Myzuspersicae、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的TERT基因同源性較高。與茶翅蝽Halyomorphahalys、苜蓿切葉蜂Megachilerotundata同源性較低(圖4)。

2.3 端粒酶TERT基因在蘿卜蚜不同齡期及不同組織的表達(dá)分析

分別用內(nèi)參基因和TERT基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)，結(jié)果顯示：qRT-TERT引物擴(kuò)增效率E=104.5%，R2=0.964；qRT-eIF引物擴(kuò)增效率E=95.0%，R2=0.998。熒光定量PCR結(jié)果顯示：端粒酶TERT基因在蘿卜蚜每個(gè)齡期都有表達(dá)(圖5A)。其中TERT基因在蘿卜蚜成蟲(chóng)期表達(dá)量最高， 4齡若蟲(chóng)期表達(dá)量最低；且成蟲(chóng)期表達(dá)量與各齡期表達(dá)量均有顯著性差異。1齡、2齡、3齡、4齡若蟲(chóng)及成蟲(chóng)期的表達(dá)量分別為0.82±0.05、0.55±0.05、0.53±0.05、0.46±0.05、1.04±0.03(df=4,10;F=31.09;P<0.01)。端粒酶TERT基因在蘿卜蚜頭部、胸部、腹部均有表達(dá)(圖5B)。其中TERT基因在蘿卜蚜頭部表達(dá)量最低，胸部次之，腹部表達(dá)量最高，且腹部表達(dá)量與頭部表達(dá)量有顯著性差異。頭部、胸部、腹部及整蟲(chóng)的表達(dá)量分別為0.69±0.09、0.87±0.17、1.14±0.12、1.05±0.03(df=3,8;F=3.105;P=0.089)。

蛋白質(zhì)來(lái)源及GenBank 登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers：麥雙尾蚜Diuraphis noxia (XP 015365598.1)；桃蚜Myzus persicae (XP 022177477.1)；豌豆蚜Acyrthosiphon pisum (XP 016663579.1)；玉米縊管蚜Rhopalosiphum maidis (XP 026806981.1)；高粱蚜Melanaphis sacchari (XP 025196581.1)；棉蚜Aphis gossypii (XP 027845459.1)；甘蔗偽毛蚜Sipha flava (XP 025417658.1)；茶翅蝽Halyomorpha halys (XP 014291834.1)；苜蓿切葉蜂Megachile rotundata (XP 012138474.1)。圖4同The same as Fig.4.

圖4 蘿卜蚜TERT基因與其他昆蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化分析

柱上不同字母表示不同齡期或不同組織TERT基因的表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)。Different letters on the column indicate significant differences in the expression levels of TERT at different stages (P< 0.05).

3 討 論

研究表明，在脊椎動(dòng)物早期的卵母細(xì)胞中端粒酶具有較高的活性，隨著卵母細(xì)胞逐漸成熟，端粒酶的活性不斷降低。但是當(dāng)卵母細(xì)胞受精后，端粒酶的活性又明顯上升，當(dāng)其發(fā)育成成熟的體細(xì)胞后，端粒酶的活性基本消失[12-13]。蚜蟲(chóng)多數(shù)營(yíng)孤雌生殖，細(xì)胞通常會(huì)分裂15～60次導(dǎo)致細(xì)胞衰老，然而蚜蟲(chóng)仍能維持正常生長(zhǎng)發(fā)育，因此猜測(cè)端粒在蚜蟲(chóng)有絲分裂過(guò)程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在蘿卜蚜生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)齡期都能檢測(cè)端粒酶TERT基因的表達(dá)，成蟲(chóng)TERT基因的相對(duì)表達(dá)量依次高于1齡、2齡、3齡、4齡若蟲(chóng)，且與2齡、3齡、4齡若蟲(chóng)有顯著性差異，驗(yàn)證了端粒酶TERT基因的重要性，對(duì)蘿卜蚜每個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段都有重要影響。

端粒酶在大多數(shù)生物正常組織或細(xì)胞中并不表達(dá)活性。但少數(shù)有增殖潛能的細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、癌細(xì)胞等都有低水平端粒酶活性表達(dá)[14-15]。本研究取發(fā)育基本成熟且表達(dá)量最低的4齡蘿卜蚜若蟲(chóng)進(jìn)行解剖，以整蟲(chóng)作對(duì)照檢測(cè)到其不同組織的端粒酶TERT基因表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)在4齡蘿卜蚜的頭部、胸部、腹部檢測(cè)到TERT基因的表達(dá)，說(shuō)明在蘿卜蚜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中端粒酶TERT基因在其各個(gè)組織內(nèi)都有重要作用。而4齡蘿卜蚜若蟲(chóng)腹部TERT基因表達(dá)量最高，這可能與4齡蘿卜蚜基本發(fā)育成熟，腹部含生殖細(xì)胞有關(guān)。

我們對(duì)TERT基因的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將早期蘿卜蚜TERT基因沉默后，蘿卜蚜很快出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且最終死亡率較高(未發(fā)表數(shù)據(jù))。圖3的同源性比較結(jié)果顯示，蘿卜蚜TERT蛋白與其他蚜蟲(chóng)的TERT序列同源性很高，同時(shí)有些區(qū)域的同源性很低。通過(guò)與已發(fā)表的2種其他昆蟲(chóng)的序列做對(duì)比，我們推測(cè)其與其他生物的TERT同源性更低。鑒于絕大部分蚜蟲(chóng)種類(lèi)都是害蟲(chóng)，我們可以選擇與其他生物同源性低的區(qū)域作為基因沉默的靶標(biāo)區(qū)域，培育轉(zhuǎn)蚜蟲(chóng)TERT或蘿卜蚜特異性(或其他蚜蟲(chóng)特異性)TERT的dsRNA轉(zhuǎn)基因作物，來(lái)防治蚜蟲(chóng)的危害，從而解決蚜蟲(chóng)化學(xué)防治中出現(xiàn)的一系列問(wèn)題。