沉香葉的薄層色譜鑒別及HPLC含量測定*

李錦云，柯澤濤，謝晨星，廖錦紅，李永輝

(1 海南森祺制藥有限公司，海南 ?？?570216；2 海南醫(yī)學院藥學院，海南 海口 571199)

沉香為海南省常用的中草藥，收載于《中華本草》[1]，沉香有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖的功效，主治便秘、腸梗阻、出血及腦缺血等癥。沉香葉為白木香Aquilariasinensis.的非藥用部位，主要分布于海南和廣東省的低海拔山地、丘陵以及路邊疏林中。其性味歸經(jīng)、功能主治和用法用量尚無報道?；瘜W成分研究表明，沉香葉中含有黃酮、多酚、多糖、氨基酸類成份[2]。已有文獻報道芫花素作為沉香葉的含量測定指標[3]。

現(xiàn)代藥理學研究[4-8]表明，沉香葉在鎮(zhèn)痛、抗炎、平喘、促進小腸推進和降血糖方面，具有同沉香藥材相似的藥效功效，沉香葉高劑量組(相當于沉香藥材的4倍劑量)與沉香藥材藥效結(jié)果最相近。研究表明沉香葉安全性較好[9]，因此建立沉香葉的質(zhì)量標準，對于擴大白木香的藥用資源，促進沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

1 儀器與材料

LC-20A型液相色譜儀(包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器、工作站)，日本島津公司；SartoriusBSA124S-CW電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；KQ-250DB數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。硅膠預制板(批號17110114)，煙臺化學工業(yè)研究所。芫花素對照品(純度>98%，批號111899-201001)，中國食品藥品檢定研究院；10批沉香葉藥材均為產(chǎn)地收集，由海南醫(yī)學院田建平教授鑒定確定為瑞香科植物沉香屬白木香Aquilariasinensis的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 性 狀

本品多破碎，完整葉片展平后呈橢圓形或卵形，長6～12 cm，寬2～5 cm。表面黃綠色或黃褐色，微有光澤，先端漸尖，基部楔形或廣楔形，邊緣光滑，具短葉柄。質(zhì)脆，搓之易碎。氣芳香，味微苦。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 對照藥材溶液的制備

取沉香葉對照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末1 g，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結(jié)果

照薄層色譜法(通則)實驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各7 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以15%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

圖1 沉香葉藥材的薄層鑒別

2.3 含量測定方法的研究

2.3.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性

圖2 芫花素(A)和沉香葉(B)的HPLC圖

優(yōu)化后的的色譜條件為(島津VP-ODS 150 mm×4.6 mm色譜柱；流動相為0.4%磷酸水-乙醇(38:62)；流速1.0 mL/min；檢測波長：332 nm；柱溫：40 ℃)，分別對空白溶劑(甲醇)、對照品溶液和樣品溶液(批號20190401)進行進樣分析，結(jié)果顯示芫花素在樣品中得到了較好的分離，理論塔板數(shù)為5248，分離度為7.19，溶劑對樣品無干擾。

2.3.2 對照品溶液的制備

取芫花素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.022 mg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過二號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3.5 線性關(guān)系考察

取對照品溶液(0.022 mg/mL)，采用序列進樣法依次進樣2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，以進樣量(ng)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明芫花素在44～308 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=4388X-7673，R=0.9999。

2.3.6 精密度考察

精密稱取沉香葉藥材粉末(20190401，過二號篩)1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液連續(xù)進樣8次，記錄芫花素的峰面積，并計算RSD值以考察精密度。結(jié)果表明：芫花素峰面積的RSD為0.92%，說明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察

精密稱取沉香葉藥材粉末(20190401，過二號篩)1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液分別與0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和14 h進樣，記錄芫花素的峰面積，并計算RSD值以考樣品穩(wěn)定性。結(jié)果表明：芫花素在14 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD為2.84%。

2.3.8 重復性考察

精密稱取沉香葉藥材粉末(20190401，過二號篩)6份，每份約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液進樣，記錄芫花素的峰面積，并計算藥材中芫花素的含量和RSD，以考察重復性，結(jié)果表明芫花素的重復性RSD為4.42%。

2.3.9 加樣回收率考察

精密稱取沉香葉藥材粉末(20190401，過二號篩)6份，每份約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分別加入對照品溶液(0.352 mg/mL)1.6 mL，再加入50%乙醇48.4 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液進樣，記錄芫花素的峰面積，并計算芫花素的加樣回收，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收結(jié)果

2.3.10 沉香葉藥材中芫花素的含量測定

精密稱取不同批次的沉香葉藥材粉末(過二號篩)各2份，每份約1.0 g，按供試品制備方法項下方法制備供試品溶液，采用序列進樣法進樣，測定供試品中蕪花素峰面積，計算樣品中芫花素的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同批次沉香葉藥材中芫花素的含量

根據(jù)上述測定結(jié)果，沉香葉中芫花素含量差異較大，范圍在0.1516～1.0939 mg/g之間。

3 結(jié) 論

3.1 薄層色譜鑒別

分別考察了不同的展開系統(tǒng)，對乙酸乙酯-甲醇-乙酸(4:0.5:0.2)、二氯甲烷-甲醇-乙酸(4:0.5:0.1)、正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)，共計3種展開劑進行了考察，見圖4，結(jié)果顯示正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)對沉香葉藥材分離效果較好，Rf值適中，故采用正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)系統(tǒng)作為沉香葉藥材的薄層色譜鑒別的展開劑。分別對熒光顯色和15%硫酸乙醇溶液顯色方法進行了考察，結(jié)果顯示15%硫酸乙醇顯色斑點清晰，因此選擇15%硫酸乙醇作為沉香葉藥材薄層色譜鑒別的顯色方法。

3.2 含量測定

分別對30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇進行了提取溶劑的考察，結(jié)果表明50%乙醇對沉香葉藥材中芫花素的提取率最高，故確定50%乙醇為最佳提取溶劑。溶劑用量(20 mL、50 mL和100 mL)的考察結(jié)果顯示，溶劑用量為50 mL時，芫花素含量最高，因此確定最佳溶劑用量為50 mL。分別對超聲提取時間10 min、20 min和30 min進行了考察，結(jié)果表明超聲30 min時，沉香葉藥材中芫花素的含量最高，故確定超聲提取時間為30 min。