miR-340 對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮性和鈉通道電流的作用*

馬頌華，邢玲燕，蘇文鳳，陳 罡1，

（南通大學(xué)1 醫(yī)學(xué)院；2 江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇226001）

神經(jīng)病理性疼痛是常見(jiàn)的慢性頑固性疼痛綜合征，患者占全球人口的7%～10%[1-2]。外傷、缺血、先天性疾病均可造成神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展，但其分子機(jī)制復(fù)雜，臨床缺乏有效的治療手段。micro RNAs（miRNAs）家族是一類(lèi)長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，于體內(nèi)廣泛存在，在生物發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。近年來(lái)，miRNAs 在神經(jīng)病理性疼痛中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，可能成為鎮(zhèn)痛治療的新方向[4-5]。脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元是軀體初級(jí)感覺(jué)傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，在感覺(jué)感知、調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)過(guò)程中起著極為重要的作用。調(diào)節(jié)DRG 神經(jīng)元電壓依賴(lài)性鈉離子通道（voltagedependent sodium channels，VDSC）的表達(dá)及功能，可直接影響神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展及維持過(guò)程[6]。本研究主要觀察miR-340 對(duì)DRG 神經(jīng)元VDSC 的作用，以揭示其與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取5～6 周齡ICR 小鼠，雌雄不拘［SPF級(jí)，許可證編號(hào)：SCXK（蘇）2019-0001，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于恒溫恒濕飼養(yǎng)籠中，12小時(shí)循環(huán)光照］。Neurobasal 培養(yǎng)基、膠原酶（type ⅠA）、胰蛋白酶、EGTA、HEPES、CsCl、Na2-ATP（Sigma 公司），miR-340-3p-mimic（吉瑪基因公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 小鼠DRG分離及神經(jīng)元培養(yǎng) ICR 小鼠以4%乙醚吸入麻醉，75%酒精消毒后迅速剪開(kāi)背部皮膚，取出胸腰段脊柱。沿矢狀面將脊柱從中線對(duì)剪，剝離脊髓，摘取神經(jīng)節(jié)。在顯微鏡下修剪DRG 周?chē)Y(jié)締組織，置于膠原酶A（1 mg/mL）37 ℃孵育30 min，再加入胰蛋白酶（0.25 mg/mL）37 ℃繼續(xù)孵育12 min，然后用Neurobasal 培養(yǎng)基清洗2 次，以終止酶的消化。用Pasteur 管輕輕吹打神經(jīng)節(jié)，獲取單細(xì)胞懸液，接種于放有玻片的培養(yǎng)皿，24 h 后用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.3 DRG 神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位記錄 采用全細(xì)胞膜片鉗電流鉗模式。細(xì)胞外液組成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 10 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7.3。電極內(nèi)液組成：K-gluconate 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L，用KOH 調(diào)pH 至7.25。保持鉗制電位-80 mV，電位設(shè)置為0，指令電壓為0，給予100 pA、500 ms 的電流脈沖誘發(fā)動(dòng)作電位。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用pCLAMP 10.2 軟件采集，采樣頻率10 kHz，濾波頻率1 kHz，Clampfit 10.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 DRG 神經(jīng)元全細(xì)胞記錄鈉電流 采用全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗模式。細(xì)胞外液組成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 12 mmol/L，用NaOH 調(diào)pH 至7.3。電極內(nèi)液組成：CsCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L，用CsOH 調(diào)pH 至7.25。電極阻抗3～5 MΩ。選擇胞膜完整性好、折光性強(qiáng)、胞質(zhì)均勻的直徑＜40 μm 的中小型DRG 神經(jīng)元進(jìn)行封接。封接電阻＞1 GΩ，破膜后進(jìn)行膜電容和串聯(lián)電阻補(bǔ)償（串聯(lián)阻抗補(bǔ)償80%），保持鉗制電位-80 mV，給予50 ms、10 mV 的階躍脈沖電壓，從-70mV 去極化至+40 mV。先記錄正常對(duì)照時(shí)的鈉通道電流，然后灌流miR-340-3p（用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液稀釋至10 μmol/L，持續(xù)灌流細(xì)胞2 min），再次給予同樣脈沖電壓刺激，記錄鈉通道電流。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異性比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元膜靜息電位的影響 在給予miR-340-3p 前DRG 神經(jīng)元的膜靜息電位（resting potential，RP）為-49.50±4.76 mV，灌流miR-340-3p（10 μmol/L，2 min）后膜的靜息電位為-52.13±5.32 mV，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元膜靜息電位的影響

2.2 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位的影響 在誘發(fā)到動(dòng)作電位的6個(gè)細(xì)胞中，在給予miR-340-3p 前誘發(fā)動(dòng)作電位數(shù)為1.8±0.75個(gè)，灌流miR-340-3p（10 μmol/L，2 min）后誘發(fā)動(dòng)作電位數(shù)為5.6±0.51個(gè)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位的影響

2.3 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元鈉通道電流的影響 如圖3 所示，miR-340-3p 可以增加鈉通道電流，電流-電壓曲線表明在激活電壓從-30 mV 至0 mV時(shí)，miR-340-3p 明顯增加了鈉通道電流密度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。激活曲線也表明，miR-340-3p 使鈉通道激活曲線左移，半激活電壓從-22.6 mV 增加至-27.4 mV。

圖3 miR-340-3p 對(duì)DRG 神經(jīng)元鈉通道電流的影響

3 討 論

近年來(lái)的研究表明，miRNAs 與疼痛關(guān)系較為密切，如在脊神經(jīng)損傷模型中，發(fā)現(xiàn)患側(cè)DRG 神經(jīng)元有63 種miRNAs 表達(dá)異常[7]；大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓縮性損傷后7 d、14 d 與假手術(shù)組相比，有111 種miRNAs 發(fā)生明顯變化[8]。miRNAs 不僅在神經(jīng)病理性疼痛中表達(dá)異常，而且還扮演著重要的調(diào)控角色。文獻(xiàn)報(bào)道，miRNAs 可通過(guò)其下游靶基因參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)，如miR-30b 通過(guò)調(diào)節(jié)DRG 神經(jīng)元NaV1.3 的表達(dá)水平削弱神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[5]，而miRNA-let-7b 也可直接作用于疼痛感覺(jué)傳入神經(jīng)元的瞬時(shí)感受器電位香草酸受體（transient receptor potential vanilloid，TRPV），調(diào)節(jié)DRG 神經(jīng)元的功能活動(dòng)，從而介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[9]。

miR-340 全長(zhǎng)22 nt，能調(diào)控多種蛋白質(zhì)的編碼和翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞周期，影響腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等，被稱(chēng)為抑癌基因[10]。本課題組在研究坐骨神經(jīng)損傷時(shí)曾觀察到miR-340 可以調(diào)節(jié)軸突再生，并且出現(xiàn)表達(dá)先降低后升高的變化[11]。行為學(xué)結(jié)果提示坐骨神經(jīng)夾傷后7天機(jī)械疼痛和熱痛感覺(jué)并不靈敏，至損傷后14天左右時(shí)動(dòng)物疼痛感覺(jué)逐漸加劇，至21天左右最敏感。提示miR-340 表達(dá)的升高可能與外周神經(jīng)損傷引發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛有一定關(guān)系。

DRG 神經(jīng)元是感覺(jué)傳入初級(jí)神經(jīng)元，在痛覺(jué)信號(hào)形成、信號(hào)傳遞以及信號(hào)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。DRG 神經(jīng)元胞體上分布多種離子通道和受體，周?chē)植凯h(huán)境的化學(xué)物質(zhì)可以改變DRG 神經(jīng)元的功能狀態(tài)，如靜息膜電位水平、興奮性等，從而刺激神經(jīng)元產(chǎn)生痛覺(jué)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-340 盡管未影響DRG神經(jīng)元的靜息膜電位，但提高了DRG 神經(jīng)元誘發(fā)放電的頻率，并增加DRG 神經(jīng)元電壓依賴(lài)性鈉離子通道（VDSC）的電流密度，提示miR-340 可能通過(guò)改變DRG 神經(jīng)元興奮性而介導(dǎo)傳遞痛覺(jué)信息。有證據(jù)表明，外周神經(jīng)損傷后DRG 神經(jīng)元上VDSC 的數(shù)量、分布及電生理特性發(fā)生改變，導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元的興奮性增高、放電頻率增加和產(chǎn)生異位放電，這些變化可能與神經(jīng)病理性疼痛的形成密切相關(guān)[12]。