電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中M2AChR、α7nAChR的影響*

石 力，周振坤，苗瑞恒，姜 敏

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院,北京 100038)

冠心病是世界范圍內(nèi)首要致死原因，目前PCI術(shù)是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的重要方法。對于ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死及不穩(wěn)定心絞痛，血運(yùn)重建能夠有效地降低心血管病不良事件[1-2]。但是，在血運(yùn)重建治療后仍然存在很多問題需要解決，在心肌缺血的基礎(chǔ)上重新恢復(fù)血流后，不僅不能改善心臟功能，反而加重心肌結(jié)構(gòu)和心臟功能的損傷，甚至是不可逆的損傷。這種心肌缺血再灌注損傷將導(dǎo)致致命性的心率失常、心力衰竭。在接受PCI術(shù)后的25%患者中會出現(xiàn)血清心肌酶的增高，包括cTnI[3-4]。大量的證據(jù)證明心肌酶的釋放增加與PCI術(shù)后的心肌損傷和延遲死亡率密切相關(guān)[5-6]。對于穩(wěn)定性心絞痛，盡管PCI能夠更大程度地緩解心絞痛，但其預(yù)后一直飽受爭議，認(rèn)為PCI與藥物治療相比，并沒有降低死亡率及心血管死亡、非致死性心肌梗死或血運(yùn)重建的風(fēng)險[7]。大約1/3的選擇性PCI術(shù)后將伴隨著心肌損傷及隨后將發(fā)生的心血管事件(包括心律失常、心功能異常)，甚至死亡[8]。

中醫(yī)藥治療對PCI術(shù)后心肌損傷有一定療效。針刺治療是一種安全無副作用且價格低廉的治療方式，尋找針刺治療PCI術(shù)后心肌損傷的治療方案，具有重要的臨床價值；尤其對于擇期PCI圍手術(shù)期心肌損傷的患者，如果能夠有效的降低其死亡率及不良心血管事件的發(fā)生率，將具有重大的臨床意義和社會價值。臨床研究及基礎(chǔ)研究均表明內(nèi)關(guān)穴對缺血心肌有特異性的保護(hù)效應(yīng)[9-12]，是治療心肌缺血性疾病常用的腧穴，不同刺激強(qiáng)度和頻率可能產(chǎn)生不同的針刺效應(yīng)[13-15]，本研究探討不同電針頻率對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)。另外，其作用機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍不十分清晰。有研究提示M2AChR參與介導(dǎo)了電針內(nèi)關(guān)穴對力竭游泳誘導(dǎo)心肌缺血的保護(hù)效應(yīng)[16]，M2AChR和α7nAChR是副交感神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在心臟的主要作用靶點(diǎn)，本研究觀察不同頻率電針對M2AChR和α7nAChR表達(dá)的影響，對其作用機(jī)制進(jìn)行初入探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及設(shè)計(jì)

清潔級健康成年雄性SD大鼠(6～8周，體質(zhì)量200～250 g)32只，均由中國食品藥品檢定研究院提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0013。動物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件溫度(25±3)℃、濕度50%～60%，可以自由取食并保持晝夜節(jié)律。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低頻電針組和高頻電針組，每組各8只。所有的實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

假手術(shù)組行開胸手術(shù)僅穿線不進(jìn)行結(jié)扎，模型組結(jié)扎冠狀動脈前降支并行再灌注處理，低頻電針組在模型組的基礎(chǔ)上于術(shù)前7 d施以低頻電針刺激，高頻電針組在模型組的基礎(chǔ)上于術(shù)前7 d施以高頻電針刺激。手術(shù)過程中記錄各組大鼠心電圖的變化。手術(shù)后取各組大鼠的血液，檢測血清中心肌損傷標(biāo)志物，取左心室心肌組織進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測心肌組織中M2AChR、α7nAChR的表達(dá)。

1.2 造模方法

大鼠術(shù)前稱重，并禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg,Sigma Aldrich；Merck KGaA,Darmstadt,Germany)對大鼠進(jìn)行麻醉，采用仰臥位進(jìn)行固定，用小動物呼吸機(jī)輔助通氣(潮氣量為5 mL/100 g，頻率60～80次/min，采用呼氣末持續(xù)正壓通氣)，通過胸骨左側(cè)第3、4肋間切開，暴露心臟。假手術(shù)組僅對大鼠于左心耳下緣2 mm處進(jìn)行左前降支分離穿線；其他各組在距左心耳下緣2 mm處將4-0號絲線穿過左前降支并在左冠狀靜脈上放置一個自制塑料套管結(jié)扎30 min，然后取下塑料套管，再灌注2 h，誘導(dǎo)缺血再灌注損傷。用RM6240B多道電生理儀(成都儀器廠)記錄大鼠Ⅱ?qū)碾妶D。

1.3 針刺方法

在2%異氟烷的吸入麻醉下行電針刺激。內(nèi)關(guān)穴位于大鼠前肢掌側(cè)腕關(guān)節(jié)上1.5 cm處，在尺骨與橈骨之間。將一次性無菌不銹鋼針灸針(0.25 mm×13 mm，華佗牌)迅速垂直刺入雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴約2 mm，并連接穴位神經(jīng)電刺激儀(韓氏-200A，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)。低頻電針組每日予強(qiáng)度為1 mA、頻率為2 Hz的電針刺激，高頻電針組每日予強(qiáng)度為1 mA、頻率為50 Hz的電針刺激，每日30 min，于術(shù)前7日每日進(jìn)行電針刺激。

1.4 心肌酶測定

術(shù)后由右房取血4 mL，離心后取血清，以日本日立7160全自動生化儀檢測大鼠血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡實(shí)驗(yàn)，Western Blot)

將心肌組織稱重，并以1∶9的比例與裂解緩沖液混合。加入含1 mM PMSF的RIPA緩沖液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，用高速組織勻漿器(IKAT10，IKA，德國)在冰上以15 000 rpm勻漿組織，然后在冰上孵育20 min。將所有組織樣品在14 000 rpm、4℃下離心20 min，并收集上清液。樣品中蛋白質(zhì)的濃度采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測定。向樣品中加入5×SDS上樣緩沖液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)將濃度調(diào)節(jié)至2 μg/μL。將樣品在100℃加熱5～10 min使蛋白質(zhì)變性。

制備10%分離膠和5%濃縮膠，并將10 μL樣品添加到每個孔中。電泳條件為：濃縮膠電泳的電壓為90 V，20 min；分離膠電泳條件為160 V，根據(jù)預(yù)先染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物來確定停止電泳的時間。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后將膜封閉45 min，并分別與抗α7nAChR抗體(ab10096，abcam)、抗M2AChR抗體(ab109226，abcam)、GAPDH抗體(稀釋比例)在冰箱中孵育過夜。然后將膜與山羊抗兔IgG(H+L)HRP[Abcam Trading(Shanghai)Company Ltd.]在室溫下孵育1 h，用TBST洗滌4次。采用曝光顯影，用Image J軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)測量條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 心電圖及ST段幅值變化

大鼠冠狀動脈LAD結(jié)扎30 min后，ST段顯著抬高(P<0.01)，QRS波群與T波融合。低頻電針預(yù)處理后，觀察到結(jié)扎30min時ST段抬高的幅度較模型組明顯降低(P<0.01)；而高頻電針預(yù)處理后，ST段抬高的幅值與模型組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)觀察到再灌注后，ST段逐漸回落。再灌注2 h時，部分大鼠出現(xiàn)ST段壓低，各組大鼠ST段幅值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶D

表1 各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)碾妶DST段幅值

2.2 血清心肌酶水平

模型組大鼠心肌酶CK-MB、LDH較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)。經(jīng)低頻電針預(yù)處理后，大鼠心肌酶CK-MB、LDH均較模型組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高頻電針組大鼠的血清CK-MB、LDH較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平

2.3 心肌組織中M2AChR、α7nAChR的表達(dá)

模型組大鼠左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR相對表達(dá)量較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)。低頻電針預(yù)處理可使心肌缺血再灌注模型大鼠左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR相對表達(dá)量明顯升高(M2AChR，P<0.05；α7nAChR，P<0.01)。高頻電針預(yù)處理對心肌缺血再灌注模型的左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR相對表達(dá)量影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2～3、表3。

圖2 各組大鼠左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR條帶灰度

注：A.M2AChR；B.α7nAChR。與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 各組大鼠左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR相對表達(dá)量

表3 各組大鼠左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR相對表達(dá)量

3 討論

心包絡(luò)與心關(guān)系密切，有“代心主事”的功能。《醫(yī)學(xué)正傳》中述：“心包絡(luò)，實(shí)乃裹心之包膜也，包于心外，故曰包絡(luò)也”。心包是心主之脈，能夠代心受邪?！额愖C治裁·心痛論治》曰：“心為君主，義不受邪，故心痛多屬心包絡(luò)病”?！妒?jì)總錄·小兒心痛》云：“包絡(luò)者，心之別脈，邪氣客之，則厥氣上逆，痞而不散，故發(fā)為心痛?！薄皟?nèi)關(guān)穴”早在《靈樞·經(jīng)脈》篇中就有所記載：“心手主之別，名曰內(nèi)關(guān)……循經(jīng)以上系于心包，絡(luò)心系。實(shí)則心痛，虛則煩心，取之兩筋間也?！眱?nèi)關(guān)穴為心包經(jīng)的絡(luò)穴，是治療心肌缺血性疾病的重要腧穴。本研究觀察到低頻電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可降低結(jié)扎冠狀動脈LAD 30 min后心電圖ST段的幅值，并可顯著降低大鼠血清心肌酶CK-MB、LDH的水平，而高頻電針預(yù)處理后未觀察到此效應(yīng)。既往有研究提示低頻電針內(nèi)關(guān)穴對缺血心肌有保護(hù)作用，可以減輕心肌缺血的病理變化[17]，與本研究結(jié)果相符合。本研究不僅證實(shí)了內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)，也提示電針參數(shù)是影響針刺效應(yīng)的重要因素，低頻電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注損傷。

心臟的自主神經(jīng)系統(tǒng)由交感神經(jīng)通路和副交感神經(jīng)通路組成， 副交感神經(jīng)通過膽堿能信號通路來調(diào)節(jié)心臟功能，迷走神經(jīng)刺激可以減輕心肌缺血再灌注損傷[18]。乙酰膽堿的受體包括毒蕈堿型受體和煙堿型受體，而M2AChR是分布于心肌細(xì)胞的主要亞型[19]，α7nAChR分布于心臟神經(jīng)元、纖維原細(xì)胞及心肌細(xì)胞[20]。有研究提示針刺內(nèi)關(guān)穴對心交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的均衡性有調(diào)節(jié)作用[21]，可使室性期前收縮模型大鼠迷走神經(jīng)放電活動減少、交感神經(jīng)放電增加[22]。本研究提示，低頻電針刺激內(nèi)關(guān)穴能夠增加心肌缺血再灌注大鼠左心室M2AChR、α7nAChR的表達(dá)，可能是通過增加心副交感神經(jīng)興奮性來實(shí)現(xiàn)的，這一假設(shè)需要在未來的實(shí)驗(yàn)中通過檢測大鼠的心率變異性及副交感神經(jīng)放電等實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

M2AChR對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制有以下幾個方面。第一，心肌缺血時可引起交感神經(jīng)的過度興奮，兒茶酚胺大量釋放，β1AR的表達(dá)顯著增加[23]，β1AR-Gs-AC-cAMP-PKA通路活性增加，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載,M2AChR與Gi蛋白相結(jié)合，分離出α亞基，以抑制AC-cAMP-PKA下游通路的活性，抑制L型Ca2+通道的激活，抑制Ca2+內(nèi)流，從而減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載；第二，M2AChR激活可增加NO的生成，在一項(xiàng)離體心肌缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)中，選擇性M2AChR受體激動劑可增加NOx的產(chǎn)生，可減輕心肌缺血再灌注損傷[24]，對LVDP有改善作用;第三，M2AChR受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)的表達(dá)來抑制金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的活性[25],MMPs的作用是影響細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和轉(zhuǎn)化，細(xì)胞之間的粘附[26],心肌組織中ECM的重構(gòu)與TIMPs和MMPs表達(dá)水平的平衡密切相關(guān)，MMPs過度表達(dá)，ECM降解減少，最終將導(dǎo)致心肌組織纖維化，影響心臟功能[27];第四，ACh可通過激活M2AChR抑制血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ) 誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，通過下調(diào)AT1受體及抑制ROS誘導(dǎo)的p38 MAPK激活及調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-3[28]。

心肌缺血再灌注損傷是一種過度的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，神經(jīng)系統(tǒng)參與整合并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，特別是膽堿能通路抑制巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子釋放的機(jī)制[29]。α7nAChR對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制主要為抑制炎癥反應(yīng)。α7nAChR激動劑可以抑制缺血再灌注損傷模型大鼠血清中TNF-α和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的水平，抑制系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，減少心肌梗死面積及降低血清TnI的水平[30]。另外，α7nAChR激動劑(GTS-21)可以抑制氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞凋亡，GTS-21可保護(hù)缺血再灌注后心肌細(xì)胞線粒體膜的完整性，降低心肌組織中ROS，抑制 JNK和 p38MAPK蛋白的磷酸化[31]。

本研究觀察到低頻電針預(yù)處理可以上調(diào)左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR的表達(dá)，而高頻電針預(yù)處理對左心室心肌組織中M2AChR、α7nAChR的表達(dá)無顯著影響。低頻電針預(yù)處理可能通過上調(diào)并激活M2AChR和α7nAChR起到抑制心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制炎癥反應(yīng)和抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，但其受體后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

低頻電針預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注損傷，并可上調(diào)心肌組織中M2AChR和α7nAChR的表達(dá)，提示低頻電針預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)可能與膽堿能受體M2AChR和α7nAChR的激活密切相關(guān)。