冷榨芝麻餅粕木脂素提取及其抗氧化研究

楊 開(kāi) 付言紅 費(fèi)立新 孫培龍,*

(1 浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院食品研究所, 浙江 杭州 310014；2 湖州榮德糧油有限公司, 浙江 湖州 313018)

芝麻(Sesamumindicum)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含脂肪酸、蛋白質(zhì)、纖維素和木脂素類(lèi)成分，其中，木脂素類(lèi)化合物是其特征成分，一般占芝麻總量的0.5%～1.0%[1]。芝麻木脂素，也稱(chēng)木酚素，因其顯著的生理活性而備受關(guān)注。研究表明，芝麻中的木脂素類(lèi)物質(zhì)具有降血壓、降血糖、抗癌、抗氧化和保護(hù)肝臟等多種生理功能[2-3]。芝麻制油后的副產(chǎn)品餅粕中仍含有較多的蛋白質(zhì)和少量的木脂素類(lèi)物質(zhì)[4]，與傳統(tǒng)高溫炒制后熱榨制芝麻油的工藝[5]相比，使用低溫冷榨工藝制得的芝麻油品質(zhì)高，所得芝麻餅粕營(yíng)養(yǎng)活性成分保留率高[6]。近年來(lái)，冷榨芝麻油發(fā)展較快，但其餅粕仍普遍作為廉價(jià)飼料、肥料進(jìn)行處理，利用率極低，因此，研究芝麻餅粕中木脂素的提取方法及其應(yīng)用可顯著提高芝麻加工副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。

在熱加工和儲(chǔ)存過(guò)程中油脂極易發(fā)生氧化酸敗，不僅會(huì)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，而且危害人體健康[7]。常見(jiàn)的人工合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、丁基羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd，BHA)等具有較好的抗氧化效果，但均具有潛在毒性，應(yīng)減少使用量或不添加[8-9]。芝麻木脂素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，目前主要采用傳統(tǒng)熱榨芝麻餅粕的方法對(duì)木脂素進(jìn)行分離提取，董英等[10]應(yīng)用甲醇溶液萃取芝麻木脂素，提取率為2.62%；任媛媛等[11]曾優(yōu)化提取芝麻中的芝麻素，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)晶純化，得出在芝麻素濃度為 1 200 μg·mL-1時(shí)最利于結(jié)晶純化。本研究以冷榨芝麻餅粕為原料，利用超聲波輔助[12]優(yōu)化提取餅粕中的木脂素，并對(duì)添加木脂素后的食用油進(jìn)行抗氧化分析，以期提高油脂儲(chǔ)藏使用過(guò)程中的穩(wěn)定性和油品質(zhì)量安全，有效提高冷榨芝麻油加工副產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

80℃低溫冷榨白芝麻餅粕，湖州榮德糧油公司；BHT、維生素E(VE)、95%乙醇、硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、對(duì)氨基苯甲醚，阿拉丁(中國(guó))有限公司；無(wú)水乙醇、正己烷、三氯甲烷、冰乙酸、淀粉、異辛烷、甲醇(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；芝麻木脂素標(biāo)準(zhǔn)品(芝麻素、芝麻林素、芝麻酚)，美國(guó)Sigma公司；菜籽油、豬油，自制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DJ-04B粉碎機(jī)，上海淀久機(jī)械制造有限公司；FS-1200超聲波處理器，上海生析超聲儀器有限公；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；VirTis BenchTop Pro真空冷凍干燥器，美國(guó)SP科學(xué)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芝麻餅粕木脂素的提取 冷榨芝麻餅粕粉碎后過(guò)60目篩，經(jīng)烘箱(105℃)干燥2 h后取適量原料，按照料液比1∶2(m/v)加入正己烷脫脂[13]，用布氏漏斗過(guò)濾后取干燥濾渣按一定料液比加入不同濃度乙醇，并在不同功率下進(jìn)行超聲提取，上層乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃下減壓濃縮后真空冷凍干燥48 h，即得到芝麻木脂素提取物。

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)條件設(shè)置：乙醇濃度90%、料液比1∶6、提取時(shí)間30 min、提取功率720 W，固定3個(gè)基礎(chǔ)條件，改變其中1個(gè)基礎(chǔ)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別以乙醇濃度(75%、80%、85%、90%、95%)、料液比(m/v)(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)、提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、提取功率(480、600、720、840、960 W)為考察因素，考察各單因素對(duì)冷榨芝麻餅粕木脂素提取率的影響。

1.3.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.5b軟件中的Box-Behnken Design設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取功率(D)為自變量，以木脂素提取率為響應(yīng)值，對(duì)冷榨芝麻餅粕木脂素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平表Table 1 Design and levels of response surface experiment

1.3.2 芝麻餅粕木脂素定性定量分析 采用HPLC法[14]對(duì)木脂素提取物進(jìn)行成分分析檢測(cè)，將芝麻素標(biāo)準(zhǔn)品、芝麻木脂素樣品用色譜級(jí)甲醇溶解，高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析，以芝麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間作對(duì)比分析。

液相色譜條件：Waters 1525高效液相色譜儀，色譜柱Cosmosil C18(4.6 mm×250 mm，填充粒度5 μm)；Waters 2487紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～50 min，50%A-50%B；50～55 min，80%A-20%B；55～60 min，100%A-0%B；60～65 min，80%A-20%B；65～66 min，50%A-50%B。檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間66 min。

(1)

(2)

式中，m為HPLC測(cè)定的凍干前芝麻木脂素總含量(μg)；m1為冷凍干燥后固體干重(g)；M為芝麻餅粕原料干重(g)。

1.3.3 添加芝麻餅粕木脂素后食用油的抗氧化分析 油脂的自動(dòng)氧化是指不飽和脂肪酸和不飽和油脂與空氣中的氧發(fā)生的氧化反應(yīng)，不需要直接的光照或者催化劑即可發(fā)生?；具^(guò)程分為誘導(dǎo)期、傳播期和終止期，而油脂的誘導(dǎo)期可由油脂的過(guò)氧化值進(jìn)行判定[15]。本試驗(yàn)以新鮮菜籽油和豬油為研究體系，采用Schaal烘箱法研究芝麻木脂素的抗氧化活性[16-17]。

1.3.3.1 不同濃度木脂素提取物對(duì)食用油抗氧化活性的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取油樣50 g，分別加入0、0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%質(zhì)量比例的芝麻木脂素提取物，烘箱溫度120℃，一定時(shí)間后檢測(cè)油樣的過(guò)氧化值(peroxide value，PV)和茴香胺值(anisidine value，AV)，并計(jì)算全氧化值(total oxidation value，TV)。PV的測(cè)定參照GB 5009.227-2016的滴定法[18]；AV、TV的測(cè)定參照GB/T 24304-2009/ISO 6885-2006[19]，TV=4PV+AV。

1.3.3.2 不同加熱溫度對(duì)添加木脂素的食用油抗氧化活性的影響 采用Schaal烘箱法[20]并略作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取油樣50 g，加入0.05%質(zhì)量比例的芝麻木脂素提取物，分別置于40、80、120、160、200℃下進(jìn)行烘制，一定時(shí)間后測(cè)定PV、AV，并計(jì)算TV值，測(cè)定和計(jì)算方法同1.3.3.1。

1.3.3.3 不同抗氧化劑對(duì)添加木脂素的食用油抗氧化活性 準(zhǔn)確稱(chēng)取油樣50 g，分別加入0.05%質(zhì)量比例的芝麻木脂素提取物、BHT、VE，烘箱溫度設(shè)置為120℃，一定時(shí)間后檢測(cè)其PV、AV，并計(jì)算TV，測(cè)定和計(jì)算方法同1.3.3.1。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理，SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 木脂素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，木脂素提取物中芝麻酚的含量較低，芝麻素和芝麻林素含量則相對(duì)較高。以木脂素標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)芝麻木脂素的3種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行混標(biāo)測(cè)定分析，芝麻餅粕提取物中的木脂素含量為3種標(biāo)準(zhǔn)品相加得到。芝麻酚的線性回歸方程為y=1.1×106x-1.5×105，R2=0.999 8，即芝麻酚含量在0.5～2.8 μg時(shí)其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好；芝麻素的線性回歸方程為y=1.8×106x-2.3×105，R2=0.999 9，即芝麻素含量在0.5～3.0 μg時(shí)其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好；芝麻林素的線性回歸方程為y=2.1×106x-1.5×105，R2=0.999 8，即芝麻林素含量在0.3～1.5 μg時(shí)其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

注：A: 芝麻木脂素標(biāo)準(zhǔn)品；B: 芝麻餅粕木脂素提取物。Note: A: Sesame lignans standard. B: Sesame cake meal lignans extracts.圖1 芝麻餅粕木脂素提取物色譜圖Fig.1 Chromatogram of sesame cake meal lignans extracts

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

圖2 各因素對(duì)芝麻餅粕木脂素提取率的影響Fig.2 Effect of different factors on the extraction yield of lignans from sesame cake meal

由圖2-A可知，隨著乙醇濃度的增加，芝麻餅粕的木脂素提取率也隨之增大，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)90%后，木脂素提取率開(kāi)始下降，可能是因?yàn)槟局匾兹苡谥袠O性溶劑，難溶于極性較強(qiáng)或較弱的溶劑。由圖2-B可知，隨著料液比的增大，芝麻餅粕的木脂素提取率先增大后減少，這是由于在低料液比條件下無(wú)法有效提取木脂素，而高料液比會(huì)使單位物料的超聲能量下降，進(jìn)而導(dǎo)致木脂素提取率降低。由圖2-C可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，芝麻餅粕的木脂素提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)短不能有效提取木脂素，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則使木脂素氧化降解，從而導(dǎo)致木脂素提取率下降。由圖2-D可知，隨著提取功率的增大，芝麻餅粕的木脂素提取率先升高后下降而后趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)榈凸β什荒苁癸炂赏耆扑椋誓局厝艹霾煌耆?；而高功率產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫可能會(huì)使木脂素分解，進(jìn)而導(dǎo)致木脂素提取率下降。綜合考慮，選擇乙醇濃度90%、料液比1∶8、提取時(shí)間40 min及提取功率600 W作為單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到的木脂素最佳提取條件。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)芝麻餅粕木脂素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。比較各因素的均方值(均方值越大表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大)，可得所選4個(gè)因素對(duì)芝麻木脂素提取得率(Y值)的影響主次關(guān)系為D>C>A>B。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性多元回歸擬合，得到芝麻木脂素提取率(Y)對(duì)乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取功率(D)二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=0.050+1.417E-003A-7.500E-004B-2.083E-003C-3.083E-003D+3.250E-00AB+3.250E-003AC+2.250E-003AD+3.250E-003BC-7.500E-004BD-2.250E-003CD-5.042E-003A2+1.958E-003B2-1.792E-003C2-2.292E-003D2。

由圖3可知，在料液比1∶8(m/v)、提取功率為720 W時(shí)，C與A交互作用顯著，提取時(shí)間對(duì)芝麻木脂素提取率影響的響應(yīng)曲面較乙醇濃度對(duì)提取率的響應(yīng)曲面陡峭，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)芝麻木脂素提取率的影響比乙醇濃度的影響大。當(dāng)料液比1∶8(m/v)、提取時(shí)間為30 min時(shí)，D與A交互作用顯著，提取功率較小時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，木脂素提取率先增加后減??；提取功率較大時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，木脂素提取率也隨之增大，說(shuō)明提取功率對(duì)提取率變化的影響較乙醇濃度的影響大。CA與DA的交互影響效果相近，差異不顯著。當(dāng)料液比1∶8(m/v)、乙醇濃度為90%時(shí)，D與C交互作用顯著，且兩因素對(duì)木脂素提取率呈現(xiàn)出近似相同的影響效果，DC的交互影響效果比DA、CA顯著。

依據(jù)本模型預(yù)測(cè)提取芝麻餅粕木脂素的最佳工藝條件為：乙醇濃度92.91%、料液比1∶10.02(m/v)、提取時(shí)間39.96 min、提取功率600.10 W，芝麻木脂素在此條件的理論提取率為572.01 μg·g-1。為檢驗(yàn)響應(yīng)面理論值的可靠性，將得到的木脂素理論優(yōu)化工藝條件修正為：乙醇濃度93%、料液比1∶10(m/v)、提取時(shí)間40 min、提取功率600 W，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得芝麻木脂素的提取率為563.81±5.62 μg·g-1，與理論值的相對(duì)誤差為1.43%，木脂素提取物得率4.35%，優(yōu)于已有文獻(xiàn)[10](2.62%)，說(shuō)明該擬合模型可靠，可用于實(shí)際應(yīng)用。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.4 添加芝麻餅粕木脂素提取物后食用油的抗氧化活性分析

2.4.1 木脂素提取物添加量對(duì)食用油抗氧化活性的影響 由圖4可知，隨著木脂素提取物添加量的增加，食用油的PV、AV和TV均呈明顯降低趨勢(shì)，說(shuō)明添加木脂素提取物后食用油的油脂品質(zhì)保持較好。當(dāng)木脂素提取物添加量低于0.1%時(shí)，菜籽油的PV顯著低于豬油(P<0.05)，表明此時(shí)菜籽油的抗氧化效果較好；當(dāng)木脂素提取物添加量達(dá)到0.10%時(shí)，菜籽油與豬油的PV無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)閯?dòng)物油脂中飽和脂肪酸含量較高，易發(fā)生氧化，故添加少量芝麻餅粕木脂素提取物不能有效抑制動(dòng)物油脂的氧化。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖4 木脂素提取物添加量對(duì)食用油抗氧化活性的影響Fig.4 Effects of lignans extracts added contnet on antioxidant activity of edible oil

2.4.2 不同加熱溫度對(duì)食用油抗氧化活性的影響 由圖5可知，隨著加熱溫度的升高，菜籽油和豬油的PV、AV和TV均有較大程度的增大。當(dāng)溫度低于120℃時(shí)，菜籽油的PV顯著低于豬油(P<0.05)，說(shuō)明此時(shí)菜籽油的抗氧化效果較好，但隨著加熱溫度的升高，2種食用油體系的抗氧化效果相當(dāng)，無(wú)顯著差異。

圖5 加熱溫度對(duì)食用油抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of heating temperature on antioxidant activity of edible oil

2.4.3 不同抗氧化劑對(duì)食用油抗氧化活性的影響 由圖6可知，添加抗氧化劑后，相比菜籽油體系，豬油的PV、AV和TV值均明顯降低，且均顯著低于空白組(P<0.05)。而與BHT、VE相比，添加芝麻餅粕木脂素提取物的食用油PV、AV和TV相對(duì)較低，說(shuō)明冷榨芝麻餅粕木脂素提取物可用于提高食用油脂的抗氧化效果。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. Different capital letters indicate significant difference at 0.05 level.圖6 不同抗氧化劑對(duì)食用油抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of different antioxidants on antioxidant activity of edible oil

3 討論

近年來(lái)，植物中有效成分的提取及利用一直是研究熱點(diǎn)之一。齊巖等[21]對(duì)葡萄加工副產(chǎn)物進(jìn)行了研究；陸浩等[22]總結(jié)了植物精油的利用途徑。木脂素類(lèi)化合物由于其廣泛的分布及藥理特性[23-24]一直是研究的熱點(diǎn)之一，但對(duì)芝麻中木脂素的研究較多集中于芝麻籽和芝麻油[25-26]?？紤]到芝麻餅粕中仍有殘留木脂素類(lèi)物質(zhì)，且冷榨制油后的餅粕質(zhì)量較好，因此本研究選用冷榨芝麻餅粕進(jìn)行木脂素類(lèi)物質(zhì)提取。何曉梅等[27]采用超聲法提取芝麻木脂素，提取量達(dá)0.120 g(以100 g芝麻渣計(jì))，本研究將靜置時(shí)間和超聲溫度替換為乙醇濃度和提取功率對(duì)提取率的影響，優(yōu)化后提取率達(dá)到4.35%。

芝麻油固有的木脂素類(lèi)物質(zhì)使其具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[28]。彭金磚等[29]將從芝麻油中提取的木酚素添加于食用油中，發(fā)現(xiàn)木酚素可提高大豆油和花生油的氧化穩(wěn)定性，但對(duì)豬油的穩(wěn)定性作用不大。本研究從冷榨芝麻餅粕中提取木脂素類(lèi)物質(zhì)，其對(duì)菜籽油和豬油的氧化穩(wěn)定性均顯著提高。本試驗(yàn)優(yōu)化得到的芝麻餅粕中木脂素提取率雖較文獻(xiàn)有所提高，但純度仍較低，此外，芝麻餅粕木脂素提取物在食用油中的溶解性較差，一定程度上影響了木脂素的抗氧化作用，故今后可應(yīng)用大孔樹(shù)脂等對(duì)木脂素提取物進(jìn)行純化，并采用超微粉碎等方法降低其粒徑。

4 結(jié)論

通過(guò)超聲波輔助乙醇提取冷榨制油后芝麻餅粕中殘留木脂素類(lèi)物質(zhì)，得到最佳提取工藝條件為：乙醇濃度93%、料液比1∶10(m/v)、提取時(shí)間40 min、超聲功率600 W，此條件下，木脂素提取率為563.81 μg·g-1。對(duì)添加芝麻餅粕木脂素提取物的食用油的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定優(yōu)化后的木脂素提取物添加量為0.15%。本研究進(jìn)一步證實(shí)了木脂素類(lèi)物質(zhì)具有優(yōu)良的抗氧化活性，對(duì)比菜籽油和豬油體系的木脂素抗氧化活性差異，發(fā)現(xiàn)木脂素提取物應(yīng)用于菜籽油體系中能更好地發(fā)揮抗氧化作用。