大麥白粉病抗性的遺傳分析與QTL定位

費新茹 朱 娟 郭 暉 郭 紅 呂 超 郭寶健 許如根,*

(1 揚州大學大麥研究所/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2 鹽都區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城 224011；3 江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司，江蘇 南京 210008)

大麥(HordeumvulgareL.)為禾本科大麥屬一年生草本植物，是世界第四大禾谷類作物，總產(chǎn)量和種植面積僅次于小麥、水稻和玉米[1]。大麥因具有豐富的膳食纖維、高β-葡聚糖含量等營養(yǎng)成分，可作為飼料、糧食、啤酒工業(yè)原料和保健用品等，受到了人們廣泛的關注[2]。然而近年來，大麥白粉病(barley powdery mildew)的發(fā)生和傳播嚴重影響了大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。大麥白粉病是由大麥?；突铙w寄生菌布氏白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.hordei，Bgh)引起的真菌病害，可造成20%～30%的產(chǎn)量損失[3]，是世界大麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[4]。因此，培育并推廣抗白粉病品種是防治大麥白粉病最經(jīng)濟有效的手段。

目前已有關于大麥白粉病抗性遺傳[5-6]、基因定位[7-8]的研究報道。如嚴雋析[9]研究發(fā)現(xiàn)大麥白粉病抗性由單個顯性基因或2對基因控制；俞志隆等[10]研究認為大麥白粉病田間抗性受多基因控制；黃金堂[11]研究認為大麥白粉病抗性遺傳符合加性-顯性遺傳模型，且加性效應作用更明顯。大麥對白粉菌的抗性主要受專化性抗病基因的控制，目前已鑒定到100多個抗性基因，其中22個?；钥共』蚍植加诓煌娜旧w上[12]。研究表明，某些抗病基因存在多個不同的復等位基因，如Weibull 等[[13]在Mla基因座共鑒定出32個抗性復等位基因。大麥野生型Mlo基因位點通過突變可以產(chǎn)生一系列不同的mlo隱性等位基因，mlo基因介導大麥幾乎對目前已知的所有Bgh生理小種都有抗性[14]。

隨著大麥白粉病病原菌生理小種的不斷分化，新菌株可能導致原有抗病品種的抗性下降甚至喪失。為確保大麥生產(chǎn)上應用品種的大麥白粉病抗性，必須不斷鑒定發(fā)掘新的大麥白粉病抗性基因并在育種中加以利用[15]。本研究以1個大麥白粉病抗感DH群體及其親本為試驗材料，對其大麥白粉病抗性進行遺傳分析與QTL定位，以期為大麥白粉病抗性基因的精細定位及分子標記輔助選擇育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 以含173個DH系的DH群體及其親本為試驗材料，該DH群體是以揚飼麥1號×Gairdner雜交F1的花藥經(jīng)組織培養(yǎng)、染色體加倍等技術構建的，其中母本為感大麥白粉病六棱飼料大麥揚飼麥1號，父本為抗大麥白粉病二棱啤酒大麥Gairdner，均由澳大利亞塔斯馬尼亞大學周美學教授惠贈。

1.1.2 田間種植 于2014年秋季將試驗材料播種于揚州大學大麥試驗田。每材料人工點播兩行，行長1.2 m，株距0.03 m, 行距0.2 m，每行點播40粒，并設3次生物學重復。田間管理同大田常規(guī)栽培方法。

1.2 方法

1.2.1 抗性鑒定方法 大麥白粉病病級調(diào)查參照Li等[16]的方法，在大麥白粉病發(fā)病始期(抽穗期)開始調(diào)查，每隔7 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查3期。每個株系連續(xù)調(diào)查10株。根據(jù)葉片病斑的有無、大小及發(fā)病部位，將大麥白粉病病級分為6級(詳見表1)。2015年4月上旬和中旬，揚州為多雨天氣，隨著氣溫逐漸上升(>15℃)，田間溫度和相對濕度較適宜大麥白粉病的發(fā)生，大麥白粉病的發(fā)病程度隨著調(diào)查時期延長而加重。按照公式計算大麥白粉病病情指數(shù)(disease index, DI)[11]：

式中，x代表每個調(diào)查植株抗性級別(0、1、2、3、4、5級)；n代表各病級的植株數(shù)量；N代表所調(diào)查的總植株數(shù)。

1.2.2 DH群體遺傳連鎖圖譜的構建方法 篩選親本間多態(tài)性好的SSR標記，利用這些多態(tài)性標記對親本及173個DH系進行基因型鑒定，與揚飼麥1號相同的帶型記為0，與Gairdner相同的帶型記為2，雜合或缺失記為1。利用JoinMap 4.0 軟件構建DH群體的分子標記遺傳連鎖圖譜。

1.2.3 QTL定位方法 利用1年3個時期的數(shù)據(jù)，采用Windows QTL IciMapping 4.0軟件[17]中的完備區(qū)間-加性模型(inclusive composite interval-additive mapping，ICIM-ADD)定位方法，掃描步長為1 cM，以LOD值2.5作為閾值[18]，QTL的命名遵循McCouch[19]的原則。

表1 大麥白粉病病級劃分Table 1 The resistance level of barley powdery mildew

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進行整理，利用 SPSS 16.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對雙親及DH群體進行抗性差異的統(tǒng)計分析。親本大麥白粉病抗性差異采用t測驗分析，DH群體大麥白粉病抗性差異采用方差分析。

2 結果與分析

2.1 DH群體及其親本大麥白粉病病情指數(shù)的差異性分析

2.1.1 DH群體及其親本病情指數(shù)的表現(xiàn) 由表2可知，3個調(diào)查時期大麥白粉病病情指數(shù)在親本間均存在極顯著差異，其中親本及DH群體大麥白粉病病情指數(shù)平均值均以第三期最高。從DH群體變異系數(shù)和變幅來看，3個調(diào)查時期白粉病病情指數(shù)在DH群體內(nèi)存在廣泛的變異，且存在不同程度的超高親或超低親遺傳現(xiàn)象。

由圖1可知，3個時期DH群體的大麥白粉病病情指數(shù)均呈連續(xù)性分布，表明可進一步對大麥白粉病抗性進行QTL定位。

2.1.2 DH群體病情指數(shù)的方差分析 由表3可知，白粉病病情指數(shù)在調(diào)查時期間、DH系間及基因型與調(diào)查時期互作間的差異均達到極顯著水平，表明白粉病病情指數(shù)在DH群體各系間存在豐富的遺傳變異。同時，DH群體發(fā)病程度還受不同調(diào)查時期氣候條件的影響。

表2 親本及DH群體的病情指數(shù)Table 2 DI of DH population and its parents

注：**表示在0.01水平差異顯著。下同。

Note:**indicates significant difference at 0.01 level. The same as following.

注：A:第一期病情指數(shù);B:第二期病情指數(shù);C：第三期病情指數(shù)。紅色箭頭代表揚飼麥1號；藍色箭頭代表Gairdner。Note:A：DI of stage Ⅰ.B:DI of stageⅡ. C:DI of stage Ⅲ. The red arrow represents Yangsimai 1. The blue arrow represents Gairdner.圖1 DH群體白粉病病情指數(shù)頻數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of the DI in DH population

2.2 DH群體遺傳連鎖圖譜的構建與大麥白粉病抗性QTL定位

2.2.1 DH群體遺傳連鎖圖譜的構建 由表4可知，對揚州大學農(nóng)學院大麥研究所保存的1 008個SSR標記在親本間進行多態(tài)性篩選，獲得91對多態(tài)性好的SSR標記。利用這些多態(tài)性標記對親本及173個DH系進行基因型鑒定，構建了覆蓋大麥全基因組 1 161.99 cM的遺傳連鎖圖譜，圖譜包含91對SSR標記，較均勻分布于大麥7條染色體上，標記間平均遺傳距離為12.77 cM，平均每條染色體上標記個數(shù)為13個。

表4 大麥DH群體遺傳圖譜各染色體的長度及標記數(shù)Table 4 The length of chromosome and number of marks in barley DH population

2.2.2 大麥白粉病抗性QTL定位 由表5可知，3個調(diào)查時期共檢測到5個與大麥白粉病抗性相關的QTLs，分布于第2、第3和第4號染色體上，分別為qPM-2Ha、qPM-2Hb、qPM-3Ha、qPM-4Ha和qPM-4Hb。第2號染色體上的qPM-2Ha在3個調(diào)查時期均被檢測到，位于Bmag0711-AWBMS56標記區(qū)間內(nèi)，可解釋7.48%～12.50%的表型變異；qPM-2Hb在第一期和第二期檢測到，位于Bmag0749-GBM1475標記區(qū)間內(nèi)，可解釋6.22%～8.13%的表型變異。第3號染色體上的qPM-3Ha僅在第三期檢測到，位于EBmac0705-HVLTPPB.2標記區(qū)間內(nèi)，可解釋3.97%的表型變異。第4號染色體上的qPM-4Ha在3個調(diào)查時期均被檢測到，位于EBmac0906-HVM68標記區(qū)間內(nèi)，可解釋23.07%～32.09%的表型變異；qPM-4Hb僅在第三期檢測到，位于GBM1388-HDAMYB標記區(qū)間內(nèi)，可解釋13.34%的表型變異。qPM-2Ha、qPM-4Ha及qPM-2Hb的加性效應均為負值，說明其白粉病抗性基因均來源于抗病親本Gairdner；qPM-3Ha和qPM-4Hb的加性效應均為正值，說明其白粉病抗性基因來源于感病親本揚飼麥1號。

表5 大麥白粉病抗性QTLs在染色體上的位置及效應分析Table 5 The chromosome positions and effects analysis of barley powdery mildew resistance QTLs

3 討論

大麥白粉病是由布氏白粉菌屬大麥?；突铙w寄生菌引起的真菌病害，其流行程度主要與寄主抗病性、氣候條件、栽培措施等密切相關[5,15]。寄主抗病性一方面取決于是否具有抗病基因，另一方面也受株型和群體結構的影響，如抗病品種病菌形成緩慢，且發(fā)病輕；葉片直立生長、長且窄的品種通常發(fā)病也較輕[20]。此外，白粉病發(fā)病程度受溫度、濕度、光照等氣候條件影響較大[20]。白粉病發(fā)生適溫為15～20℃，低于10℃時發(fā)病緩慢，低于0℃或高于28℃不發(fā)?。桓邼駰l件有利于發(fā)病，相對濕度大于70%有可能引起病害流行；白粉病病菌的分生孢子對直射陽光較敏感，散射光有利于病害發(fā)生[20-21]。播種量大，田間植株密度大會加重白粉病[22]。若施用氮肥過多，會造成植株貪青、徒長等利于白粉病的發(fā)生[22]；而水肥不足、土壤干旱、植株生長衰弱、抵抗力低也利于該病發(fā)生[20]。本研究中親本和DH群體在3個調(diào)查時期白粉病發(fā)病程度呈逐漸加重的趨勢，這與發(fā)病期間氣溫逐漸上升、雨水勻和利于白粉菌侵染大麥相關。

大麥白粉病一般表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，同時受環(huán)境及基因與環(huán)境互作的影響[10]。目前，已有部分大麥白粉病抗性QTLs被定位[23-24]、克隆[25-26]并應用于大麥品種改良[27-28]。本研究檢測到的部分QTLs與已報道的基因可能是等位基因或同一基因，如qPM-2Ha在染色體上的位置與Hilbers等[29]利用Ris03S×Sultan 和Alf ×Vogelsanger Gold 2構建的2套DH群體定位到的位于RFLP分子標記cMWG660與MWG97之間的抗白粉病基因MlLa位置相近，表明其可能是MlLa的等位基因。qPM-4Ha的位置與G?rg等[30]利用大麥近等基因系定位到與RFLP分子標記MWG032共分離的抗白粉病基因Mlg位置相近，即其可能是Mlg的等位基因。Hinze等[31]利用6個不同基因型的大麥品種構建的回交群體定位到第4號染色體上，與RFLP分子標記bAL88/2共分離的抗白粉病基因mlo，qPM-4Hb與mlo位置相近，可能是其等位基因。第2號染色體上qPM-2Hb和第3號染色體上qPM-3Ha所在區(qū)域至今沒有相關的白粉病QTL報道，可能是新的抗大麥白粉病QTL位點，但尚需進一步驗證。

4 結論

本研究共檢測到5個與大麥白粉病抗性相關的QTLs，其中qPM-2Ha、qPM-4Ha和qPM-4Hb與已報道的基因可能是等位基因或同一基因，位于第2號染色體上qPM-2Hb和位于第3號染色體上qPM-3Ha所在區(qū)域目前尚沒有相關的白粉病抗性位點報道，可能是新的抗大麥白粉病QTL位點。本研究結果為大麥白粉病抗性QTL的發(fā)掘、基因精細定位、基因克隆和分子標記輔助選擇育種奠定了一定的理論基礎。