基于表型性狀的春蘭種質(zhì)遺傳多樣性分析

傅巧娟，李春楠，張曉瑩，趙?？?/p>

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024）

0 引言

春蘭(Cymbidium goeringii)又名草蘭、山蘭或朵朵香，為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)多年生草本地生植物，其味清幽，花色淡雅，具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。廣泛分布在中國(guó)南方各省，日本與朝鮮半島南端也有分布。春蘭是栽培歷史最為悠久、分布最廣、資源最豐富、選育園藝栽培品種最多的蘭花之一[1]，也是人們最為喜歡的種類之一。

種質(zhì)資源是遺傳研究與育種應(yīng)用的基礎(chǔ)，如何科學(xué)有效地評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系也是資源鑒定、保護(hù)、品種改良等工作的重要內(nèi)容[2]。運(yùn)用形態(tài)學(xué)性狀檢測(cè)遺傳變異是最古老和簡(jiǎn)便易行的方法，也是植物學(xué)分類的主要依據(jù)之一[3]。利用植物的表型性狀研究其遺傳多樣性已被廣泛應(yīng)用于番茄[4]、蘿卜[5]、柑橘[6]、梨[7]、狼尾草[8]、紅花[9]、芍藥[10]、一串紅[11]等多種園藝植物中。近年來(lái)，張韶伊等[12]、陳君梅等[13]對(duì)部分春蘭種質(zhì)進(jìn)行了形態(tài)多樣性研究，但所涉及的種質(zhì)及檢測(cè)的性狀較少。筆者以120份春蘭種質(zhì)為材料，從50 個(gè)表型性狀研究分析其遺傳多樣性，以期為春蘭的資源鑒定、保護(hù)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的春蘭種質(zhì)共120份（表1），每份10株以上，分別來(lái)自浙江、安徽、福建、江蘇、廣東等地，統(tǒng)一種植于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)資源圃2年以上，統(tǒng)一管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)采集每份種質(zhì)在連續(xù)2年的開花期，選3株以上植株，參考農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南春蘭》（以下簡(jiǎn)稱《測(cè)試指南》），選取50個(gè)表型性狀（包括38個(gè)質(zhì)量性狀和12個(gè)數(shù)量性狀）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

表1 春蘭種質(zhì)及來(lái)源

質(zhì)量性狀包括植株葉姿、大小，葉形、葉片扭曲、葉藝、葉色，開花期，花?；ㄇ噙帮@色、子房著生處苞片顏色、苞片斑點(diǎn)及條紋，花主色，花被片數(shù)，萼片及花瓣姿態(tài)，萼片顏色數(shù)量、主色、邊緣色、斑點(diǎn)、條紋、中萼外卷程度、側(cè)萼邊緣卷曲度，花瓣著生狀態(tài)、唇瓣化、顏色數(shù)量、主色、邊緣色、斑點(diǎn)、條紋，唇瓣主色、邊緣色、斑點(diǎn)、條紋及外卷程度，蕊柱數(shù)量、中部色、頂部色、斑點(diǎn)及藥帽顏色等，以《測(cè)試指南》為標(biāo)準(zhǔn)，通過目測(cè)獲得。

數(shù)量性狀包括葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬，花梗長(zhǎng)，花朵、中萼片、側(cè)萼片、唇瓣等的長(zhǎng)和寬，中萼片寬長(zhǎng)比等，采用直尺測(cè)量，測(cè)量值保留1位小數(shù)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 采集的數(shù)據(jù)均在Microsoft Office Excel 2007 中進(jìn)行整理，分別計(jì)算各種質(zhì)數(shù)量性狀的平均值(M)、最大值(Max)、最小值(Min)、極差(R)、標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(CV)，并對(duì)各性狀進(jìn)行9～10級(jí)分類，1級(jí)＜M-2S，10 級(jí)≥M+2S，中間每級(jí)差0.5S（M為群體性狀平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差），利用IBM SPSS Statistics 21軟件中非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov(K-S)法檢驗(yàn)各性狀是否遵從正態(tài)分布。對(duì)符合正態(tài)分布的性狀，依據(jù)劉孟軍[14]概率分級(jí)法，用M-1.2818S、M-0.5246S、M+0.5246S、M+1.2818S 4 個(gè)分點(diǎn)分為5 級(jí)，使1～5 級(jí)的出現(xiàn)概率分別為10%、20%、40%、20%和10%；用M-0.5246S、M+0.5246S 2 個(gè)分點(diǎn)分為3 級(jí)，使1～3 級(jí)的出現(xiàn)概率分別為30%、40%、30%。對(duì)于不符合正態(tài)分布的性狀，根據(jù)《測(cè)試指南》各性狀分級(jí)數(shù)，按照其數(shù)據(jù)的實(shí)際分布情況進(jìn)行分級(jí)[15]。

質(zhì)量性狀依據(jù)《測(cè)試指南》進(jìn)行量化，其中顏色性狀從淺到深記為1～9。采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)[式(1)]分析種質(zhì)多樣性[16-18]。

式中，Pi為某性狀第i級(jí)出現(xiàn)的頻率。

1.2.3 主成分分析及聚類分析 運(yùn)用IBM SPSS Statistics 21 軟件進(jìn)行主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量性狀多樣性

2.1.1 有序多態(tài)性狀多樣性分析表2顯示的是有序多態(tài)性狀多樣性，可以看到，26 個(gè)質(zhì)量性狀Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(I)在0.13～1.69之間。I值最高的為蕊柱中部主色，其次是子房著生處苞片顏色1.65；相關(guān)顏色的性狀I(lǐng)值均較高，多樣性更豐富。I值最低的是花瓣著生狀態(tài)，其次是萼片顏色數(shù)量0.24。

2.1.2 二元性狀分布表3顯示的春蘭12個(gè)質(zhì)量性狀均表現(xiàn)為2 種形式，即“有”或“無(wú)”?？梢钥吹剑瑓⒃嚨?20 份材料唇瓣均無(wú)條紋；葉片無(wú)扭曲、無(wú)葉藝、萼片無(wú)斑點(diǎn)占87%以上，而花梗花青甙顯色、唇瓣斑點(diǎn)以“有”居多，占85%以上；其他5個(gè)性狀2種表現(xiàn)形式均占較高比例，多樣性更為豐富。

2.2 春蘭數(shù)量性狀變異分析

群體數(shù)量性狀的差異性和多樣性常用變異系數(shù)(CV)來(lái)反映，變異系數(shù)大則分化程度高、多樣性顯著，相反則群體相對(duì)穩(wěn)定、一致性較高。120 份春蘭種質(zhì)數(shù)量性狀的變異情況見表4。總體上看，各性狀的CV值均在13%以上，變異程度較高；其中CV值最低的為葉片數(shù)(13.5%)，說(shuō)明該性狀在各種質(zhì)間相對(duì)穩(wěn)定；其次是唇瓣長(zhǎng)、唇瓣寬，分別為18.3%、20.4%；CV值最高的為花梗長(zhǎng)(48.8%)，多樣性豐富。

表2 春蘭質(zhì)量性狀Shannon-Weaver多樣性指數(shù)比較

表3 二元性狀分布比例 %

2.3 數(shù)量性狀的分布規(guī)律及分級(jí)

K-S檢驗(yàn)結(jié)果（表5）顯示，中萼片寬長(zhǎng)比和側(cè)萼片寬的Sig.值大于0.05，符合正態(tài)分布，按1.2.2 進(jìn)行分級(jí)；其余11個(gè)性狀Sig.值均小于或等于0.05，不符合正態(tài)分布。對(duì)11個(gè)非正態(tài)分布性狀，按照實(shí)際測(cè)量結(jié)果的10%、20%、40%、20%、10%或30%、40%、30%的比例進(jìn)行5級(jí)或3級(jí)的分級(jí)，確定分點(diǎn)值，將數(shù)量性狀進(jìn)行統(tǒng)一化和規(guī)范化的描述[15]。

2.4 主成分分析

從檢測(cè)的51個(gè)表型性狀指標(biāo)中，選取變異較大（I值或CV值較高，二元性狀分布分散）的41 個(gè)指標(biāo)（表6）進(jìn)行主成分分析，按照特征值大于1的原則，提取前13 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到71.301%。第一主成分的特征值6.066，方差貢獻(xiàn)率最大14.795%，占主導(dǎo)地位；特征向量絕對(duì)值較大的性狀有中萼片長(zhǎng)、中萼片寬、中萼片寬長(zhǎng)比、側(cè)萼片長(zhǎng)、側(cè)萼片寬、花朵寬、花朵長(zhǎng)等，其中中萼片寬、中萼片寬長(zhǎng)比、側(cè)萼片寬為負(fù)值，說(shuō)明它們與其余4 個(gè)性狀之間呈負(fù)相關(guān)，決定了春蘭花朵的大小及形狀，為花朵大小因子和花型因子。第二、第三和第四主成分的特征值分別為4.853、2.667、2.309，方差貢獻(xiàn)率11.837%、6.505%、5.632%，主要由唇瓣長(zhǎng)、唇瓣寬、花主色、萼片中部主色、花瓣中部主色、花瓣邊緣色、蕊柱頂部色、唇瓣外卷程度、花瓣斑點(diǎn)、花瓣條紋、花梗花青甙顯色等性狀決定，為花色因子、唇瓣因子。第六主成分開始主要由植株大小、花梗長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)等性狀起決定作用，稱為株型因子、葉形因子。6 個(gè)因子可視為春蘭種質(zhì)評(píng)價(jià)與雜交育種中親本選擇的主要表型指標(biāo)。

表4 春蘭數(shù)量性狀變異分析

表5 數(shù)量性狀K-S正態(tài)性檢驗(yàn)及概率分級(jí)分點(diǎn)值

2.5 聚類分析

采用歐式距離(Euclidean distance)、Word 法對(duì)120份種質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到樹型聚類圖（圖1）?？梢钥吹剑跉W氏距離為18.1處可將群體分為2大類，第一大類(Ⅰ)包含24 份種質(zhì)，主要以素心為主，唇瓣較?。ū?）；另外96 份種質(zhì)聚為第二大類。在歐氏距離為9.2 處，第二大類又分為3 個(gè)亞類：第一亞類以奇花型為主(Ⅱ)，葉片狹長(zhǎng)，花大，但萼片較小，共11 份種質(zhì)；第二亞類(Ⅲ)38 份種質(zhì)，包含一些色花、蝶花等種質(zhì)；其余47 份種質(zhì)聚為第三亞類(Ⅳ)，表現(xiàn)為萼片較短、寬，且基本無(wú)條紋。從聚類情況還可以看到，花朵大小、花色、唇瓣色相近的首先聚在一起，如第一大類(Ⅰ)以素心（花朵黃綠色，無(wú)斑點(diǎn)、條紋）為主；大元寶和大品蝶均為蝶花；銀邊春蘭、金邊春蘭、雪山和雙嬌均為覆輪復(fù)色花；冠豸彩球與DFQ、盛世牡丹與GCQQ 等均為奇花等；Ⅱ類花朵較大；Ⅳ類花朵較小、萼片較寬。與主成分分析結(jié)果一致。

表6 入選主成分的特征值、貢獻(xiàn)率及特征向量

續(xù)表6

3 結(jié)論

筆者從50 個(gè)表型性狀入手，研究分析120 份春蘭種質(zhì)遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)春蘭表型多樣性極為豐富，無(wú)論是質(zhì)量性狀還是數(shù)量性狀，都表現(xiàn)出極為豐富的多樣性，與張韶伊等[12]、陳君梅等[13]的研究結(jié)果一致。其中顏色性狀Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(I)較高，花梗長(zhǎng)CV值最高，多樣性更豐富，與陳君梅等[13]的研究結(jié)果一致；葉片數(shù)變異相對(duì)穩(wěn)定，數(shù)量性狀的分布規(guī)律多數(shù)不符合正態(tài)分布，可能與種質(zhì)來(lái)源及人工選擇栽培有關(guān)。

主成分分析結(jié)果顯示，提取的前13個(gè)主成分6個(gè)因子綜合反映了春蘭的表型，但其累積貢獻(xiàn)率只有71.301%，說(shuō)明各性狀貢獻(xiàn)率較為分散，累積貢獻(xiàn)率增長(zhǎng)不明顯，也表明性狀變異具有多向性。聚類分析發(fā)現(xiàn)，花朵大小、花色、唇瓣色相近的首先聚在一起，與主成分分析結(jié)果相符；但與傳統(tǒng)春蘭品種按瓣形進(jìn)行區(qū)分的結(jié)果不盡一致，王曉英等[1]和牛田等[19]的試驗(yàn)結(jié)果也認(rèn)為，聚類結(jié)果與春蘭的瓣形分類是不一致的，這可能與春蘭種質(zhì)的人為選擇及多樣性有關(guān)，因此，分類標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步研究。此外，季祥彪等[20]研究表明，野生春蘭樣品的聚類具有很強(qiáng)的地域性；牛田等[19]研究認(rèn)為，來(lái)自于相同地區(qū)的春蘭品種的親緣關(guān)系較近，與本試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能與春蘭在不同地區(qū)間交流引種增多有關(guān)，也可能與選擇分析的表型性狀有關(guān)，這些將在今后的研究工作中進(jìn)一步完善。

表7 4個(gè)類群13個(gè)數(shù)量性狀指標(biāo)比較

4 討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性的豐富程度對(duì)品種改良、新品種選育有著直接作用。了解春蘭的遺傳多樣性水平，對(duì)解析其遺傳與進(jìn)化，理解人為或生態(tài)變遷的影響力具有極大的參考價(jià)值，也是未來(lái)遺傳變異的起點(diǎn)和遺傳改良的前提[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到春蘭的遺傳多樣性分析及鑒定中，目前應(yīng)用于春蘭的分子標(biāo)記主要為SRAP[19]、RAPD[20]、AFLP[1,21]及ISSR[22-23]等。同工酶技術(shù)也應(yīng)用于春蘭品種間的親緣關(guān)系分析[24]。而表型性狀是植物生長(zhǎng)的最直觀表現(xiàn)，受植物本身基因型和環(huán)境因素的綜合作用，表現(xiàn)出穩(wěn)定性和變異性共存的特點(diǎn)[25]，長(zhǎng)期以來(lái)，植物種質(zhì)資源的分類、鑒定及育種材料的選擇通常是依據(jù)表型性狀來(lái)開展的[26-28]。當(dāng)然，將表型分析與其他手段或技術(shù)結(jié)合研究種質(zhì)遺傳多樣性，將更有助于資源的合理評(píng)價(jià)、鑒定、開發(fā)和利用。