microRNA在水稻抗逆性狀中的研究進展

張子怡

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510000）

0 引言

隨著人口的日益增長，食物需求量不斷上升。據(jù)推測，到2030年，世界人口將增至80億，糧食需求量增加60%，然而現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致空氣水土污染逐年增加，全球氣候變暖，良田減少，自然災(zāi)害頻發(fā)，中國農(nóng)作物面臨越來越多的不良環(huán)境條件。水稻是重要的糧食作物，據(jù)推測，到2025 年水稻的總產(chǎn)量必須是現(xiàn)有的2倍才能滿足人口的需求，但20世紀以來，水稻產(chǎn)量的增長水平一直處于徘徊不前的境地。MicroRNA（微小RNA）是20世紀才被人們發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控因子，有關(guān)其的研究也是日益增多，探明微小RNA在生物體內(nèi)調(diào)控生物生理行為的機理并將其合理運用以達到對人類有用的目的是近幾年的研究熱點。同樣，在水稻抗逆性狀的研究上也應(yīng)重點關(guān)注miRNA 對水稻所產(chǎn)生的影響。目前有關(guān)miRNA 在水稻抗逆性中起到的作用研究成果還不多，綜述更是少之又少，這與其研究的難度有關(guān)，但從現(xiàn)有的研究成果中不難看出miRNA在水稻抗逆性中起到的作用非常顯著，可見在未來這一領(lǐng)域必將是熱點與重點，故現(xiàn)作此研究進展綜述，希望對未來miRNA 在水稻抗逆性方面的運用研究有一定的幫助。

1 microRNA在植物中的應(yīng)用研究

成熟的microRNA是一類細胞內(nèi)普遍存在的長度約為22個核苷酸的微小RNA，簡稱miRNA，其通過形成miRISC（miRNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物），并與靶mRNA結(jié)合進而使靶mRNA 降解或是抑制靶mRNA 的翻譯的原理，達到調(diào)控相應(yīng)抗逆性相關(guān)基因的目的。

1990 年Napoli 等在一次意外的矮牽牛花實驗首次發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象，而1993 年Ambros 等在秀麗線蟲實驗中通過對比2 個突變體的非編碼RNA 編碼情況，更加明確了轉(zhuǎn)錄后沉默的原理，這一系列突破性發(fā)現(xiàn)使人們的視線聚焦于miRNA 在生物機理中怎樣以及如何起作用上，開辟了基因表達調(diào)控的新研究方向[1]。而植物miRNA 的研究起步要比動物晚，2002年才首次在擬南芥中克隆到miRNA，由此開始了對植物miRNA的大量研究，種種研究結(jié)果表明：miRNA在植物生長發(fā)育（如葉形態(tài)發(fā)生、花的分化和發(fā)育、根的分化和發(fā)育等）、細胞周期調(diào)控、基因表達及抗逆性方面起到極為關(guān)鍵的重要作用。

影響作物的生長因素有土壤、溫度、濕度、水質(zhì)、鹽堿等，根據(jù)Levitt的分類，非生物脅迫主要分為溫度脅迫、礦物脅迫和水分脅迫3 類，其中，溫度脅迫細分為低溫危害與高溫危害，礦物脅迫主要有鹽害、鋁害、重金屬危害、缺鐵、缺磷等，水分脅迫細分為干旱與漬害。

非生物脅迫下植物細胞能夠形成一些脅迫蛋白來抵抗逆境，如低溫脅迫下合成抗凍蛋白，通過抑制冰晶生長從而減輕冰晶對類囊體的傷害，又如高溫脅迫下合成熱激蛋白以提高抗熱性等。面對逆境脅迫，不僅只有脅迫蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)滲透機制也是提高抗逆性的一大手段[2]。大量實驗表明[3-7]，低溫、高溫、干旱、洪澇、鹽堿等不良條件下，逆境會誘導(dǎo)參與滲透相關(guān)基因的表達，形成一些可提高細胞溶質(zhì)濃度的物質(zhì)如氨基酸、有機酸、無機離子等，使植物能從外界持續(xù)獲取水分。人們繼而發(fā)現(xiàn)了無論在何種逆境條件下，植物體內(nèi)的脫落酸含量都會增加，如面對10℃以下的低溫，水稻幼苗葉片和黃瓜子葉的脫落酸含量明顯增加，因此認為脫落酸是一種脅迫激素，即應(yīng)激激素，它在植物抗逆原理中發(fā)揮了極大作用[8-9]。Wei等[10]利用miRNA 芯片對干旱脅迫下13 個物種的miRNA的表達情況進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)了只有含有脫落酸的miRNA靶基因才會對干旱脅迫做出反應(yīng)，如miR167、miR168、miR528 在干旱條件下表達下調(diào)，從而導(dǎo)致其各自的靶基因（磷脂酶D，促分裂原活化蛋白激酶，過氧化物酶）表達上調(diào)，進而導(dǎo)致植物葉片氣孔關(guān)閉以及多種抗氧化系統(tǒng)活性的增加，最終提高了對干旱的抵抗能力。

據(jù)研究[11-15]，植物機體內(nèi)已自然進化出一系列應(yīng)對非生物脅迫的機制，而miRNA在這些機制中起到關(guān)鍵作用，對脅迫敏感的miRNA可能通過應(yīng)激反應(yīng)控制靶基因的表達，而最新研究表明植物抗逆性與抗逆性相關(guān)基因及其啟動子在堿基序列上的GC含量有一定關(guān)系，含量越高則基因穩(wěn)定性越高，抗逆性越強[16]。

2 mircoRNA在水稻抗逆性中的應(yīng)用研究

2.1 抗旱

在所有谷類作物中，水稻對干旱因素最為敏感，尤其在生長期時，即使是溫和的干旱脅迫，也會導(dǎo)致不同程度的不育和減產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，每年栽培水稻的用水量占每年農(nóng)業(yè)總用水量的70%，在水資源日益匱乏的現(xiàn)狀下，具有干旱抗性的水稻品種越來越受人們歡迎。

研究表明，miRNA 家族中的不同miRNA 功能并不完全一樣，例如在水稻體內(nèi)的miR169 家族中僅有miR169g 是在水稻抗旱脅迫中起作用的，且不同植物體內(nèi)的miRNA 面對逆境脅迫時采取的對應(yīng)措施也不一定相同，如擬南芥體內(nèi)的miR169 家族中，miR169a和miR169c 的調(diào)節(jié)方式剛好與水稻相反，干旱會抑制它們的表達，卻提高了擬南芥的抗旱性[17]。

miR393 是很多植物在抵抗干旱脅迫中起重要作用的miRNA，miR393通過對靶基因TIR1（轉(zhuǎn)運抑制劑反應(yīng)蛋白1）進行調(diào)控使介導(dǎo)的生長素信號受到抑制而達到抗旱目的。

Zhou 等[18]于2010 年利用芯片掃描首次發(fā)現(xiàn)了19個新的在水稻抗旱性中發(fā)揮作用的miRNA，其中11個為上調(diào)表達，分別是miR170、miR172、miR397、miR408、miR529、miR896、miR1030、miR1035、miR1050、miR1088、miR1126；8個為下調(diào)表達，分別為miR395、miR474、miR845、miR851、miR854、miR903、miR901、miR1125。同時，Zhou 發(fā)現(xiàn)，ptc-miR474 與ath-miR854a 家族均在干旱脅迫下表現(xiàn)出嚴格的上調(diào)表達，ath-miR170 和ath-miR396 家族則表現(xiàn)為嚴格下調(diào)表達[19]。Sun 等于2017 年用DK151 和IR64 作為實驗對象，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下DK151 產(chǎn)量明顯高于IR64，DK151體內(nèi)響應(yīng)干旱逆境的已知miRNA數(shù)量相較于IR64 高出265 個，Sun 等通過熒光定量PCR 技術(shù)預(yù)測了其中12個miRNA對應(yīng)的220個靶基因，但只有miR1425-5p、miR1861b、miR1861h、miR1490、miR396e-5p、miR398p 和miR5521 這8 個miRNA 檢測到了剪切片段，同時他們也發(fā)現(xiàn)降低一些miRNA的表達可能會導(dǎo)致一些受干旱誘導(dǎo)而發(fā)生調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子表達呈上升或下降趨勢，這將導(dǎo)致一些其他的非生物脅迫響應(yīng)能力上升或下降。

2.2 抗冷害

水稻喜高溫，種子發(fā)芽最低溫度8℃～14℃，最適30～35℃，最高38～42℃。分蘗期日均20℃以上,穗分化適溫30℃左右；低溫會使枝梗和穎花分化延長，抽穗適溫25～35℃，開花最適溫30℃左右，低于20℃或高于40℃時，授粉會受嚴重影響，可見水稻對低溫抗性不高，故培育抗冷害的水稻品種能有效降低環(huán)境溫度對水稻生長的阻礙作用，使種植難度降低，可播種時間擴寬，進而增加產(chǎn)量，提高質(zhì)量。

截至目前的研究，水稻中對冷害脅迫起響應(yīng)的miRNA 主要有24 種，分別為miR157、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166、miR167、miR169、miR172、miR319、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR408、miR446、miR528、miR530、miR535、miR812、miR814、miR1425和miR1436[20-23]。

根據(jù)報道出來的文獻，擬南芥中miR167 與miR319面對冷害脅迫時均上調(diào)表達，而在水稻幼苗體內(nèi)卻是上調(diào)表達，待miRNAs成熟后再表現(xiàn)下調(diào)[24]。

從real-time PCR 的測試分析可得出，osa-miR393基因在水稻受到冷脅迫之后有持續(xù)表達上調(diào)的趨勢，而osa-miR396c 基因的表達趨勢是先上調(diào)再回落的，雖然2 個基因在冷脅迫后的表達模式不同，且表達量與實驗對照組差距不大，但總的來說這2 個基因是能響應(yīng)冷脅迫的，推測原因可能有2點：一是實驗中冷脅迫處理時間長短未能達到要求，二是由于一個RISC復(fù)合體可以和多個靶mRNA結(jié)合并完成剪切過程，故無需miRNA 表達量很大即可達到使靶基因表達發(fā)生變化的目的[25]。

Jeong 等[26]發(fā)現(xiàn)了miR1425 在水稻面對冷害脅迫時會下調(diào)表達來調(diào)節(jié)RF-1（生育恢復(fù)基因）的表達，從而提高水稻耐冷性。

2.3 抗鹽

在全球范圍內(nèi)，土壤鹽化都存在逐漸加劇的問題，中國約有2000 萬km2的鹽堿地，大約占耕地面積的10%，如能提高現(xiàn)有作物的耐鹽能力或是開發(fā)出耐鹽新品種，那必然會大幅度減輕當(dāng)前糧食短缺的程度。鹽脅迫會影響到植物幾乎所有的生命進程，盡管植物先天擁有一些耐鹽的能力，但是鹽脅迫仍然會造成作物產(chǎn)量大幅下降以及質(zhì)量不達標(biāo)。因此研究植物的耐鹽機制、開發(fā)利用耐鹽植物資源有著重要的意義。

植物抗鹽實際就是在鹽濃度遠高于正常生長環(huán)境下的鹽濃度這一條件下，如何保證自身仍能獲取足夠的水分與養(yǎng)分，以到達正常新陳代謝與生長發(fā)育的需求。不同種類的植物抗鹽方式和抗鹽程度不同，同一植物的不同生育期抗鹽能力也不同，耐鹽范圍在1.5%～2.0%的稱為鹽生植物，而耐鹽范圍僅在0.2%～0.8%表達的則是甜土植物，水稻就是典型的甜土植物。面對鹽脅迫植物采取的應(yīng)對措施有避鹽和耐鹽2 種，避鹽即減少體內(nèi)積累的鹽分，如檉柳屬會通過莖葉表面的鹽腺排出體內(nèi)多余的鹽分，耐鹽則是通過生理機制如改變滲透調(diào)節(jié)和加強新陳代謝等忍受進入細胞的鹽分。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 脅迫會誘導(dǎo)H+-ATPase基因表達以達到水解ATP排出H+的目的，使質(zhì)膜上的Na+/H+反向運輸器利用跨膜H+濃度將Na+排出細胞再將H+重新運輸回來[27]。

研究證明miRNA 是通過調(diào)控與耐鹽性相關(guān)的基因這一途徑來間接參與植物耐鹽響應(yīng)的。miR397 可作用于LACs和CKB3等相關(guān)抗鹽蛋白使其下調(diào)表達，從而提高植物耐鹽性。miR393 作用于靶基因TIR1，間接調(diào)控耐鹽相關(guān)基因P5CDH和SR05的表達以達到明顯增強植物耐鹽性的目的。Jung 和Kang 研究發(fā)現(xiàn)miR417的下調(diào)表達會降低植物幼苗生存率，進一步的實驗證明其與鹽脅迫對抗也密切相關(guān)。Zhu等[16]通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)水稻幼苗在鹽脅迫條件下體內(nèi)共有85 個內(nèi)含子miRNAs 表達，其中差異表達的有24個。最新研究證明了in-miRNAs與宿主基因的轉(zhuǎn)錄加工表達相關(guān)度并不高，這意味著部分miRNAs 可能有著相對獨立的一套基因表達原理，Chun 等[28]利用RTPCR 技術(shù)驗證了水稻中的miR-3026、miR3028 和mi-R3029 就可能具有獨立啟動子。Dong 等于2016 年克隆了水稻內(nèi)含子miRNA-3026的啟動子。

根據(jù)目前的研究，水稻miRNA中參與耐鹽性調(diào)控的有miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR165、miR167、miR169、miR171、miR319、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR530、miR1436、miR1848，隨著鹽脅迫處理的時間增加，水稻中的miR156、miR164、miR167、miR169、miR171 在根部表達量增加，miR159、miR160、miR319、miR398、miR1484 先減少后增加。而能確定的水稻miRNA 對鹽脅迫應(yīng)對的機理有：miR156 作用于靶基因SPL 與SPB，miR159 作用于靶基因MYB，miR160 和miR167作用于靶基因ARF，miR162 作用于靶基因P450，miR164作用于靶基因NAC，miR165和miR530作用于靶基因HD-ZIP，miR169作用于靶基因NF-YA，miR171作用于靶基因SCC，miR319 作用于靶基因MYB，miR393 作用于靶基因TIR1、E3 泛素連接酶、F-box 蛋白，miR395作用于靶基因APS，miR396作用于靶基因GRL，miR397 作用于靶基因Laccase，miR398 作用于靶基因CSD，miR1436作用于靶基因WRKY[29-31]。

2.4 缺營養(yǎng)元素及抗重金屬危害等

植物作為地球上生命主要形態(tài)之一，相對于動物而言，無法選擇生存環(huán)境，并且不易移動，故其所處的周圍環(huán)境對其生長發(fā)育影響比較大。土壤中的鐵、氮、硫、磷、鉀等元素是參與水稻生長發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，然而自然界所提供的營養(yǎng)元素量有限，故通過人工調(diào)節(jié)水稻面臨缺營養(yǎng)元素時的反映機制有利于提高水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量，通過miRNA簡介調(diào)控水稻體內(nèi)參與營養(yǎng)運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)表達量是一個有效方法。而土壤中的微量元素也有很多會對水稻幼苗的生長造成抑制，如銅、鎘等，故通過miRNA 調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)脅迫蛋白的表達也有助于提高水稻的抗重金屬脅迫能力[32]。

研究表明，植物在面對缺磷條件下，體內(nèi)的miR395、miR399、miR398、miR827 均會做出反應(yīng)，水稻體內(nèi)的AtPHR1 的同源基因OsPHR2 被認為是缺磷脅迫下調(diào)節(jié)miR399 表達的重要調(diào)控因子，根據(jù)05 年Fujii 等[33]的研究，miR399 是通過下調(diào)表達抑制了PHO2 的表達以此來調(diào)控磷元素在水稻根部的運輸。有報道顯示，水稻D3 同源基因MAX2 能在磷脅迫條件下做出響應(yīng)。Yang 等的研究顯示，水稻中miR528潛在靶mRNA很多，Yang通過5'RLM-RACE在日本晴水稻中驗證得到miR528對OsAO和D3的調(diào)控作用。

Bartel[34]、Jeong等[35]的實驗結(jié)果表明，miR395在水稻和擬南芥面臨低硫脅迫時會下調(diào)表達，這是由于轉(zhuǎn)錄因子SLIM1的調(diào)控作用，miR395能夠調(diào)節(jié)硫轉(zhuǎn)運體基因以及硫代謝相關(guān)基因APS1、APS3 和APS4 的表達。另有研究表明，盡管miR395和硫轉(zhuǎn)運體基因在擬南芥根中的表達都受缺硫誘導(dǎo)，但它們被誘導(dǎo)表達的細胞定位并不同，miR395主要在韌皮部薄壁細胞中被誘導(dǎo)，而硫轉(zhuǎn)運體基因的表達主要在木質(zhì)部薄壁細胞中被誘導(dǎo)。但是目前為止更精確的miR395 表達模式還未被解釋清楚。

水稻在面對低氮環(huán)境時有63 個保守miRNAs，26個新miRNAs 具有表達差異，表明這些調(diào)控miRNAs可能與水稻應(yīng)對低氮脅迫有關(guān)，但目前對這些共調(diào)控miRNA 的功能尚不清楚。值得注意的是，miR169 經(jīng)常被報道出與植物的抗低氮有關(guān)，擬南芥中面對低氮脅迫時會抑制miR169的表達，從而調(diào)節(jié)靶基因NFYA家族轉(zhuǎn)錄因子的表達。同時也有報道說miR169 和NFYA 基因與干旱脅迫有關(guān)，可能表明在低氮環(huán)境下植物的耐旱性會有所提高[36]。

植物面對Cu脅迫時miR398會誘導(dǎo)超氧化物歧化酶SOD增加表達量以合成更多的Cu/Zn-SOD酶，從而達到提高Cu抗性的目的。而在少Cu條件下，miR398卻會上調(diào)表達使CSD1 和CSD2 減少，故適量的Cu 其實有益于植物生長[37-40]。朱子亮等[25]指出植物面對鎘脅迫時miR171 和miR393 率先做出反應(yīng)，而不同植物面對重金屬脅迫時率先做出反應(yīng)miRNA種類也不同，如在蒺藜苜蓿應(yīng)對重金屬脅迫中做出反應(yīng)的miRNA有miR171、miR319、miR393、miR529，且均表達上調(diào)。實驗證明，與水稻應(yīng)對鎘脅迫密切相關(guān)的miRNA主要有miR165 家族，miR171a、miR171b、miR408 家族、miR604、miR2122、miR528、miR397b、miR167j、miR1856、miR398a和miR5808等。

水稻是重要的模式作物，自完成了基因組測序后，研究miRNAs對水稻抗重金屬危害的作用于機理成為可能，但目前對于水稻體內(nèi)特定的抗重金屬相關(guān)miRNAs的種類與功能的研究取得的成果較少[41-43]，因此參考文獻也較少，可見未來在這一方面應(yīng)會有更大更重要的突破。

3 展望

原來QTL 的研究大多集中在孤立的蛋白質(zhì)編碼基因上，很明顯現(xiàn)在還需考慮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼RNA，如miRNA，越來越多的研究表明miRNA是在研究作物抗逆機制中應(yīng)當(dāng)重點關(guān)注的QTL，并且合理運用它可以很大程度地提高作物抗逆性，降低環(huán)境對作物的影響和種植難度，提高作物產(chǎn)量與質(zhì)量[44]。

MiRNA作為較晚被發(fā)現(xiàn)的一種基因調(diào)控手段，是時下的研究熱點，而miRNA在水稻抗逆性中的應(yīng)用近幾年在國內(nèi)也是如火如荼地展開，雖說在一些方面取得了比較成功的研究成果，但相較于其他提高水稻抗逆性手段的研究階段來說，其還處于剛起步的階段，筆者總結(jié)了目前存在的問題及其對應(yīng)的解決方法：（1）很多水稻特異的miRNA種類尚未被發(fā)現(xiàn)。MiRNA總數(shù)十分龐大，約占總基因的1%，要解決這一問題，研發(fā)高效快速的檢測、測序、分析技術(shù)（例如CRISPR 敲除miRNA 或其靶位點）十分重要[45-48]。（2）對于已發(fā)現(xiàn)的miRNAs中還有很多尚未清楚其功能或是其對應(yīng)的靶基因，解決此問題需要科研工作者的努力。（3）對于已經(jīng)探明靶基因和其所負責(zé)的功能的miRNA，要找尋運用它的方法，切實有效地將它運用于生產(chǎn)中。