鐮刀菌脅迫培養(yǎng)后對(duì)土壤熏蒸劑的敏感性評(píng)價(jià)

黃邦成，楊進(jìn)成，顧凡，楊童雨，張鐘，余代宏，楊美芳，李銣，湯東生

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南玉溪 653100；3云南元江縣植保站，云南元江 653300）

0 引言

鐮刀菌(Fusarium)是一種世界性分布的真菌，無(wú)性時(shí)期屬于半知菌亞門，有性時(shí)期為子囊菌亞門，不僅能在土壤中越冬越夏，還可以引起多種土傳病害的發(fā)生，常見的有枯萎病、猝倒病、立枯病、疫病、根腐病、青枯病、根結(jié)線蟲病、軟腐病、菌核病等[1]，由鐮刀菌侵染引起大豆鐮刀菌根腐病是一種分布廣、危害重、且難以防治的世界性土傳病害，廣泛分布于世界各大豆產(chǎn)區(qū)，目前該病已經(jīng)對(duì)中國(guó)的大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[2]。由鐮刀菌侵染引起的香蕉枯萎病已在世界各地大面積發(fā)生，被喻為香蕉的“癌癥”，一旦發(fā)生無(wú)藥可治，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。鐮刀菌能在土壤中存活多年，一旦有適合的時(shí)機(jī)就會(huì)侵入寄主植物，因而均有很強(qiáng)的傳染性和隱蔽性，目前很難在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上進(jìn)行有效地防控，而土壤消毒是目前防治由鐮刀菌等引起的土傳病害較為有效的措施之一[4]。

土壤熏蒸劑一般在作物種植之前進(jìn)行施用。按熏蒸劑在常溫下的物理狀態(tài)，可以分為氣態(tài)熏蒸劑、液態(tài)熏蒸劑和固態(tài)熏蒸劑3 種類型，熏蒸前灌溉可有效降低通過(guò)注射方式施入土壤的熏蒸劑的散失[5]。利用熏蒸劑處理土壤能不同程度地防治作物土傳病害的發(fā)生，有利于作物的生長(zhǎng)，提高作物的產(chǎn)量，并且影響土壤中微生物數(shù)量的變化（在整個(gè)處理期內(nèi)，細(xì)菌和放線菌的數(shù)量大多呈先抑制后激活狀態(tài)，而真菌大多表現(xiàn)為長(zhǎng)期抑制狀態(tài)）[6]。在土壤熏蒸劑中效果最好且應(yīng)用最廣的溴甲烷能防治多種細(xì)菌、真菌、線蟲引起的病蟲害[7]，但是相關(guān)科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)溴甲烷是一種消耗臭氧層物質(zhì)(ODS)，長(zhǎng)期使用會(huì)破壞大氣中的臭氧層，從而形成“臭氧空洞”[8]，2015 年1 月1 日中國(guó)全面禁止溴甲烷在農(nóng)業(yè)行業(yè)中使用。氯化苦熏蒸土壤可殺滅土壤微生物，對(duì)細(xì)菌（芽胞桿菌除外）、放線菌、真菌的殺滅率均在85%以上，有效地減少土傳病害病原菌的數(shù)量，從而降低土傳病害的侵染率[9]。1,3-二氯丙烯被用作一種優(yōu)良的殺線蟲劑，同時(shí)對(duì)一些地下害蟲有效，但對(duì)一些雜草和病原真菌的抑制作用有限[10-13]。將1,3-二氯丙烯與氯化苦混用后可以拓寬其防治效果，氯化苦加1,3-二氯丙烯的混劑已在國(guó)外很多國(guó)家得到了廣泛應(yīng)用，對(duì)鐮刀菌、黃萎病菌和雜草都有良好的防效[14]。

目前，土壤熏蒸劑在病蟲害防控中存在效果不穩(wěn)定，持效期短的問題[15]。筆者猜測(cè)不同的環(huán)境因子脅迫下，病原菌對(duì)熏蒸劑的抵抗能力不同，從而影響了熏蒸效果。因此，筆者先對(duì)病原菌進(jìn)行脅迫處理（pH、鹽脅迫、溫度），然后再熏蒸，再接種后正常培養(yǎng)，以此揭示脅迫處理后對(duì)熏蒸效果是否產(chǎn)生影響，以期為田間熏蒸提供更好的方案，從而提高熏蒸效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

室內(nèi)試驗(yàn)于2017年3月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院2樓雜草實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試藥劑與菌株

（1）供試藥劑。30%氯化苦乳油，山東圣泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；30%1,3-二氯丙烯油懸浮劑，山東圣泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；50%氰氨化鈣顆粒劑，寧夏大榮化工冶金有限公司。

（2）供試菌株。由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草實(shí)驗(yàn)室保存的鐮刀菌株(Fusarium oxysporumf.sp.)。

1.2.2 供試培養(yǎng)基PDA 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂16 g，用純水定容到1000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同濃度的藥劑制備將3種熏蒸劑加水分別稀釋到500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍，制成不同稀釋倍數(shù)的熏蒸劑。

1.3.2 3種熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的毒力測(cè)定將上述配制好的藥劑倒入自制簡(jiǎn)易干燥器中180 mL（約1/4），取直徑為1 cm 的打孔器將鐮刀菌打孔取出接種于PDA 培養(yǎng)基中，將已接種的培養(yǎng)基放入干燥器中密閉熏蒸處理，3 次重復(fù)，并設(shè)置空白對(duì)照，每24 h 取出用十字交叉法測(cè)量菌餅直徑并記錄。

1.3.3 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)pH脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在PDA 培養(yǎng)基中加入NaOH或HCl，分別調(diào)配成pH 5、6、7、8、9的培養(yǎng)基，用直徑為1 cm的打孔器將培養(yǎng)好的鐮刀菌打孔取出，接種于上述不同pH 的培養(yǎng)基中放置于電熱恒溫培養(yǎng)箱（溫度：28℃）培養(yǎng)120 h，直至對(duì)照組(CK)pH 7 的培養(yǎng)基已基本長(zhǎng)滿。即獲得不同pH 下培養(yǎng)的鐮刀菌。將在不同pH下培養(yǎng)好的鐮刀菌放置于干燥器中，內(nèi)置有效成分含量為0.21 mg/L 的30%氯化苦乳油進(jìn)行熏蒸處理，處理時(shí)間為72 h。

處理結(jié)束后將其取出，接種直徑為1 cm的鐮刀菌菌餅于培養(yǎng)基中央并放置于恒溫培養(yǎng)箱（溫度28℃）培養(yǎng)120 h，3次重復(fù)，并設(shè)置空白對(duì)照，每24 h取出用十字交叉法測(cè)量菌餅直徑并記錄，計(jì)算其抑制率。

1.3.4 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)不同鹽濃度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在PDA 培養(yǎng)基中加入NaCl，分別配成含鹽量為10、100、200、400、800 mmol/L的培養(yǎng)基，用直徑為1 cm的打孔器將事先培養(yǎng)的鐮刀菌打孔取出，接種于上述不同含鹽量的培養(yǎng)基中并放置于電熱恒溫培養(yǎng)箱（溫度28℃）培養(yǎng)120 h，直至對(duì)照組含鹽量為0 mmol/L的培養(yǎng)基已基本長(zhǎng)滿。即獲得不同含鹽量下培養(yǎng)的鐮刀菌。將在不同含鹽量下培養(yǎng)好的鐮刀菌放置于干燥器中，內(nèi)置有效成分含量為0.21 mg/L 的30%氯化苦乳油進(jìn)行熏蒸處理，處理時(shí)間為72 h。處理結(jié)束后將其取出，接種直徑為1 cm 的鐮刀菌菌餅于培養(yǎng)基中央并放置于恒溫培養(yǎng)箱（溫度28℃）培養(yǎng)，3 次重復(fù)，并設(shè)置空白對(duì)照，每24 h 取出用十字交叉法測(cè)量菌餅直徑并記錄，直至空白對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿為止。計(jì)算其抑制率。

1.3.5 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)極端溫度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，將鐮刀菌接種與培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別放置于4℃冰箱、40℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5、10、15天。對(duì)照組鐮刀菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h，3次重復(fù)，待培養(yǎng)結(jié)束后，即獲得4、40℃溫度下培養(yǎng)的鐮刀菌。將在不同溫度下培養(yǎng)好的鐮刀菌放置于干燥器中，內(nèi)置有效成分含量為0.21 mg/L的30%氯化苦乳油進(jìn)行熏蒸處理，處理時(shí)間為72 h。處理結(jié)束后將其取出，接種直徑為1 cm的鐮刀菌菌餅于培養(yǎng)基中央并放置于恒溫培養(yǎng)箱（溫度28℃）培養(yǎng)，3次重復(fù)，并設(shè)置空白對(duì)照，每24 h取出用十字交叉法測(cè)量菌餅直徑并記錄，直至空白對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿為止，計(jì)算其抑制率。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)與分析抑制率的計(jì)算見公式(1)。

使用Excel 2010、SPSS 1.9 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用DPS 7.5 Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的抑制率

通過(guò)表1 可以看出，30%氯化苦乳油對(duì)鐮刀菌的熏蒸效果比較明顯，同一個(gè)稀釋倍數(shù)下抑制率顯著高于其他2種藥劑。30%氯化苦乳油在稀釋2000倍時(shí)的抑菌率都高于30%1,3-二氯丙烯油懸浮劑和50%氰氨化鈣顆粒劑稀釋500倍時(shí)的抑菌率，30%1,3-二氯丙烯油懸浮劑和50%氰氨化鈣顆粒劑稀釋倍數(shù)很低時(shí)，熏蒸效果也不好，同一種藥劑對(duì)鐮刀菌的熏蒸效果隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低。

表1 3種熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的抑制率 %

2.2 3種熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的毒力

表2表明，30%氯化苦乳油對(duì)鐮刀菌的毒力最高，EC50為0.21 mg/L，30%1,3-二氯丙烯油懸浮劑的毒力次之，EC50為1.05 mg/L，50%氰氨化鈣顆粒劑對(duì)鐮刀菌毒力最低，EC50為20.61 mg/L，故本研究后續(xù)試驗(yàn)選取30%氯化苦乳油作為試驗(yàn)藥劑。

2.3 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)pH 脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

由表3表明，不管培養(yǎng)時(shí)間多長(zhǎng)，30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)pH 5、6、8、9 處理的鐮刀菌熏蒸效果都比對(duì)照pH 7的熏蒸效果差，表現(xiàn)出顯著性差異，4個(gè)處理在培養(yǎng)48 h時(shí)抑菌率差異不顯著。培養(yǎng)120 h以后pH 6的處理表現(xiàn)出最小的抑制率，菌絲生長(zhǎng)最快。pH 5、9的處理對(duì)鐮刀菌的抑制率基本相同，都顯著小于pH 7的抑制率。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，所有處理對(duì)鐮刀菌的抑菌率基本都呈下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 h以后抑制率達(dá)到最小。

表2 3種熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的毒力測(cè)定

表3 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)pH值脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

2.4 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)不同鹽濃度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

表4 表明，培養(yǎng)時(shí)間在96 h 之前對(duì)照組對(duì)鐮刀菌的抑制率都是最高的，而且顯著高于經(jīng)過(guò)不同鹽脅迫的各處理。隨著鹽濃度的增加，抑制率呈下降趨勢(shì)，鹽濃度為800 mmol/L 時(shí)菌絲生長(zhǎng)最好，抑制率達(dá)到最小。培養(yǎng)48 h以后各處理對(duì)鐮刀菌的抑制率隨時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 h時(shí)達(dá)到最低值。

2.5 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)極端溫度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

表5數(shù)據(jù)表明，對(duì)照組28℃（5天）對(duì)鐮刀菌的抑制率與極端溫度處理組40℃（10 天）、40℃（5 天）、4℃（15天）、4℃（10 天）相比都表現(xiàn)出顯著性差異，極端溫度4℃（5天）處理組除96 h時(shí)，其他時(shí)間段對(duì)鐮刀菌的抑制率也都顯著低于對(duì)照組。處理組40℃（15 天）菌絲生長(zhǎng)最慢、最少，抑菌率達(dá)到最大。除了處理組40℃（15天）外，其他處理在培養(yǎng)48 h以后抑菌率都呈下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 h時(shí)都達(dá)到最小抑菌率，極端溫度4℃處理隨著處理時(shí)間的增加，對(duì)鐮刀菌的抑制率呈下降趨勢(shì)。

3 結(jié)論

3.1 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)pH 值脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

30%氯化苦乳油對(duì)鐮刀菌有較好的直接熏蒸效果，但經(jīng)pH（偏酸或偏堿）脅迫處理后的鐮刀菌對(duì)30%氯化苦乳油表現(xiàn)出不敏感，反而比對(duì)照生長(zhǎng)更好，熏蒸效果變差。近年來(lái)，隨著長(zhǎng)期連作，大量農(nóng)藥的不合理使用，導(dǎo)致土壤pH值多偏酸性，有些地塊土壤pH 5以下，用土壤熏蒸劑對(duì)其治理時(shí)，鐮刀菌對(duì)熏蒸劑表現(xiàn)不敏感，從而導(dǎo)致防治效果大大降低，這就給由鐮刀菌引起的多種土傳病害的治理提出了更大的挑戰(zhàn)。

表4 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)不同鹽濃度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

表5 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)極端溫度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

3.2 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)不同鹽濃度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)鹽脅迫下的鐮刀菌對(duì)30%氯化苦乳油不敏感，熏蒸再接種后菌絲生長(zhǎng)率比對(duì)照更好，隨著鹽濃度的增加抑制率逐漸降低，說(shuō)明高鹽條件下土壤熏蒸劑對(duì)鐮刀菌的熏蒸效果變差，而隨著化肥和農(nóng)藥的大量使用，鹽堿地日益增多，使得鐮刀菌對(duì)熏蒸劑表現(xiàn)越來(lái)越不敏感，對(duì)田間防治效果產(chǎn)生了巨大的影響。

3.3 30%氯化苦乳油對(duì)經(jīng)過(guò)極端溫度脅迫處理的鐮刀菌的熏蒸效果

病原菌的越冬越夏環(huán)節(jié)是病原菌完成其生活史的重要步驟，探究鐮刀菌在極端溫度下對(duì)藥劑的敏感性至關(guān)重要。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在極端溫度下鐮刀菌對(duì)土壤熏蒸劑的敏感程度并不同，經(jīng)過(guò)高溫和低溫處理后鐮刀菌對(duì)外界有更好的抵抗能力。

4 討論

中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)的安全與發(fā)展關(guān)乎國(guó)家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與國(guó)家安全，改革開放以來(lái)由于保護(hù)地栽培技術(shù)在中國(guó)的普及和應(yīng)用，極大地加快了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但是隨著重茬種植的大面積推廣，農(nóng)藥化肥的大量使用，使得土壤中的病原菌、害蟲、雜草日益增多，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了巨大影響。土壤熏蒸是目前保護(hù)地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治土傳病害最經(jīng)濟(jì)最有效的措施，可有效控制土壤中的連茬病蟲害[16]。土壤熏蒸劑能有效防治由腐霉菌鐮刀菌絲核菌等引起的漚根爛秧病、猝倒病、立枯病、軟腐病、根腐病、枯萎病、黃萎病等土傳病害及預(yù)防根結(jié)線蟲，清潔土壤，為植株創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)環(huán)境[17-18]。從十字花科蔬菜中提取的辣根素對(duì)多種土傳病害和部分氣傳病害有防控作用[19]，威百畝進(jìn)行土壤消毒后施用生物菌肥能明顯提高番茄產(chǎn)量[20]，使用棉隆對(duì)草莓地消毒以后能使草莓增產(chǎn)20%以上[21]，威百畝處理土壤能有效防治由尖孢鐮刀菌引起的黃瓜枯萎病和瓜果腐霉引起的黃瓜猝倒病，有效提高黃瓜品質(zhì)與產(chǎn)量[22]，二甲基二硫熏蒸土壤后，能有效防治線蟲、土傳真菌、雜草等[23]。

土壤熏蒸劑在土壤中的分解強(qiáng)度取決于土壤的理化性質(zhì)和熏蒸劑的類型。理想的熏蒸劑需要靶標(biāo)有害生物盡可能長(zhǎng)時(shí)間地暴露于藥劑中，而且病原菌要對(duì)熏蒸劑敏感，才能取得較好的防效[15]。土壤質(zhì)地不同，栽培管理模式不同，相應(yīng)的理化指標(biāo)如土壤的pH、有機(jī)質(zhì)含量、鹽含量等也會(huì)有很大差異，這些都會(huì)對(duì)土壤熏蒸劑的熏蒸效果產(chǎn)生重要的影響。本研究結(jié)果表明，在相應(yīng)的土壤理化性質(zhì)改變后（土壤pH偏酸偏堿，土壤鹽含量增加），能夠使得土壤病原菌（鐮刀菌）對(duì)土壤熏蒸劑（30%氯化苦乳油）表現(xiàn)出不敏感，降低了防治效果，增加了防治難度。假設(shè)通過(guò)某種物理或者化學(xué)的方法讓鐮刀菌重新對(duì)熏蒸劑敏感，這樣就能在很小的用藥量下取得很好的防治效果，這也是筆者下一步將會(huì)開展的研究工作。