大孔吸附樹脂純化羥基積雪草苷的工藝

雷芳 ，羅祥敏 ，陳偉，劉世會，何珺*

1. 貴州大學藥學院（貴陽 550025）；2. 貴州省生化工程中心（貴陽 550025）

積雪草為傘形科積雪草屬積雪草（Centella asiatica（L.）Urb.）的干燥全草。性寒，味苦、辛，具有清熱利濕、解毒消腫之功效，用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、砂淋血淋、癰腫瘡毒、跌撲損傷[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)積雪草主要含有三萜（Triterpenoids）及其苷類、揮發(fā)油（Volatile oil）、黃酮類（Flavonoids）、生物堿（Alkaloids）等化合物。大量文獻表明羥基積雪草苷可以促進傷口愈合、刺激肉芽組織生長、促進表皮角質(zhì)化，并有助于形成新的結(jié)締組織[2]，臨床上常用于治療各種創(chuàng)傷、燒灼傷，痤瘡以及整形美容手術(shù)等引起的瘢痕。戴衛(wèi)波等[3]研究表明，羥基積雪草苷具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護等藥理作用；王雪松等[4]研究表明，羥基積雪草苷具有調(diào)節(jié)免疫和降低血糖的作用；Li等[5]研究表明，羥基積雪草苷通過調(diào)節(jié)cmetpkc-erk1/2-COX-2-PGE2級聯(lián)的活性來抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，表明羥基積雪草苷對肝生長因子相關(guān)的肝癌有控制作用。

現(xiàn)有研究報道主要是對積雪草中的積雪草總苷進行富集純化[6-10]，其中鄢玉芬等[6]研究結(jié)果表明，采用大孔吸附樹脂的方法對積雪草中積雪草總苷進行分離純化含量由1.64%提高至60.67%；黃建軍等[7]的研究結(jié)果表明，積雪草總苷含量為61.28%；杜建平等[8]的研究結(jié)果表明，通過大孔吸附樹脂分離純化得到的積雪草總苷純度為55.27%。但沒有對積雪草中羥基積雪草苷進行富集純化的相關(guān)報道，因此首次采用大孔吸附樹脂對羥基積雪草苷進行富集純化研究，期望為工業(yè)生產(chǎn)高含量積雪草提取物提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥材與試劑

干燥積雪草（2019年9月購于貴州貴陽花果園中藥材市場）；對照品羥基積雪草苷（批號：17111621，純度≥96.1%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；DM130、D101、AB-8、LX-60型大孔吸附樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）；HPD417、HPD300型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公）司；甲醇、乙腈（色譜級，德國MWE-CK）；磷酸（天津市永大化學試劑有限公司）；水為娃哈哈水（貴陽娃哈哈昌盛飲料有限公司）和自制蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，G1312C Bin Pump VL，G7129A Vialsampler，G1316A TCC，G1315D DAD VL（美國安捷倫科技公司）；BSA124S和BT25S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；YA·ZD·5型不銹鋼電熱蒸餾水器（上海南陽儀器有限公司）；其他為一般常規(guī)儀器。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基積雪草苷含量測定

2.1.1 HPLC測定色譜條件

色譜柱：Neptune C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸水（0 min 25∶75→20 min 25∶75→30 min 30∶70→40 min 40∶60→50 min 50∶50）梯度；柱溫25 ℃；檢測波長206 nm；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

取適量羥基積雪草苷對照品，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液進行超聲溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.193 mg/mL的羥基積雪草苷的對照品溶液，即得。

2.1.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取4，8，12，16和20 μL羥基積雪草苷對照品溶液，注入液相色譜儀，按2.1.1小節(jié)的色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積，分別以進樣量（μL）為橫坐標（X），以測得峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。羥基積雪草苷標準曲線的回歸方程為：Y=163.76X+10.06，R2=0.999 6，表明羥基積雪草苷在0.772～3.860 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 積雪草提取液的制備

精密稱取100 g積雪草粗粉，加20倍量的50%乙醇浸漬提取1次，2 h，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏靜置過夜，加水稀釋，得積雪草提取液。

2.1.5 樣品含量測定

分別精密吸取10 μL對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，HPLC色譜圖如圖1和圖2所示，富集純化后積雪草提取物如圖3所示。

圖1 對照品色譜圖

圖2 藥材色譜圖

圖3 純化產(chǎn)品

2.2 羥基積雪草苷大孔樹脂柱分離純化工藝研究

2.2.1 樹脂預處理[8]

將DM130、D-101、HPD417、AB-8、LX-60和HPD300 6種型號樹脂，先用95%的乙醇浸泡24 h，用蒸餾水洗至無醇味，用5% NaOH浸泡3～5 h，水洗至中性，再用5% HCl浸泡3～5 h水洗至中性，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附試驗

稱取預處理后的樹脂，各3 g，分別置于250 mL三角瓶中，各添加80 mL積雪草提取液，置23 ℃恒溫搖床，以160 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附12 h，使羥基積雪草苷充分吸附；濾過，吸干樹脂表面水分，加入50%乙醇，各200 mL，置23 ℃恒溫搖床，以160 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩解吸12 h，使羥基積雪草苷充分解吸。檢測濾液和洗脫液中羥基積雪草苷的含量，并計算飽和吸附量和解吸率。結(jié)果見表1。

表1 不同大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解析性能

由表1可知，DM130、D101、AB-8、LX-60和HPD300的吸附率以及解吸率均較好，回收溶劑，從提取物純度可以看出D101純度明顯高于LX-60、HPD300、AB-8和DM130，并且D101每千克價格明顯低于LX-60、HPD300、AB-8和DM130。綜合考慮，選擇D101型大孔吸附樹脂作為生產(chǎn)用羥基積雪草苷純化樹脂。

2.2.3 動態(tài)吸附與解吸試驗考察

2.2.3.1 泄露曲線的繪制

取30 mL（20.0 g）D101型大孔吸附樹脂裝柱，量取300 mL 1.80 mg/mL的積雪草藥液，以1 BV/h的流速上柱進行吸附，收集流出液，每20 mL為一個流份，共收集16份，以羥基積雪草苷泄露質(zhì)量濃度為縱坐標（Y），收集流份為橫坐標（X）作泄露曲線，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，第1～第11份時幾乎無羥基積雪草苷泄露，第12份出現(xiàn)泄露，故確定20 g D101大孔吸附樹脂的羥基積雪草苷安全上樣量為19.8 mg/g。

圖4 D101大孔吸附樹脂泄露曲線圖

2.2.3.2 上樣流速的確定

取30 mL（20.0 g）D101型大孔吸附樹脂，各3份，分別濕法裝入相同規(guī)格的層析柱中，再取3份220 mL等質(zhì)量濃度羥基積雪草苷提取液上柱，并控制上樣流速分別為1，2和3 BV/h，進行動態(tài)吸附，分別收集流出液，測定并計算流出液中羥基積雪草苷含量，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著上樣流速的增大，流出液中羥基積雪草苷含量也隨之升高，說明高流速上樣時目標成分損失大，低流速可使目標成分充分吸附于樹脂。綜合考慮，選擇上樣流速1 BV/h。

圖5 不同上樣流速的吸附效果（n=2）

2.2.3.3 洗脫劑乙醇體積分數(shù)的考察

將處理好的40.0 g（60 mL）D101大孔吸附樹脂濕法裝柱，上樣440 mL，上樣流速為1 BV/h，水洗至流出液無顏色，再依次用10%，30%，50%，70%和90%乙醇各3 BV進行洗脫，分別收集各乙醇洗脫液，用高效液相色譜法測定并計算洗脫液中羥基積雪草苷含量，結(jié)果如圖6所示。

通過分析圖6可知，當乙醇體積分數(shù)＜50%時，洗脫液中羥基積雪草苷含量隨洗脫劑濃度的升高而升高；當乙醇體積分數(shù)＞50%時，洗脫液中羥基積雪草苷含量呈下降趨勢，70%以及更高體積分數(shù)乙醇洗脫液中羥基積雪草苷含量甚微，即用50%乙醇就能最大限度地將羥基積雪草苷解吸完全，故確定最佳洗脫溶劑為50%乙醇。

圖6 不同體積分數(shù)乙醇的解吸效果

2.2.3.4 50%乙醇洗脫用量的考察

將200 mL上樣液上40 g（60 mL）D101型大孔吸附樹脂，上樣流速1 BV/h，水洗至無色，用6 BV 50%乙醇洗脫，每60 mL收集一份洗脫液，用高效液相測定并計算洗脫液中羥基積雪草苷含量，結(jié)果見圖7。

通過分析圖7可知，第2 BV時50%乙醇洗脫液中羥基積雪草苷含量已達到最大值，第4 BV時50%乙醇洗脫液中羥基積雪草苷含量甚微，說明已基本解吸完全。因此，確定4 BV為50%乙醇洗脫劑最佳用量。

圖7 洗脫劑用量對解吸的影響

2.2.3.5 樹脂最佳徑高比的考察

取3根等規(guī)格的樹脂柱，濕法裝入處理好的D101，使徑高比分別為1∶4，1∶6和1∶8，上等體積等質(zhì)量濃度上樣液，水洗至無色，再用5 BV 50%乙醇洗脫，收集每1 BV 50%乙醇洗脫液，測定并計算提取物中羥基積雪草苷質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖8所示。

圖8 徑高比對羥基積雪草苷吸附及解吸影響

通過分析圖8可知，當徑高比為1∶4時，羥基積雪草苷集中被第1，第2和第3 BV洗脫劑解吸出來，但是樹脂床過短導致目標物質(zhì)泄漏，徑高比為1∶6和1∶8均能將羥基積雪草苷吸附解吸。三者比較，徑高比為1∶6時分離效果最好，利于得到高含量產(chǎn)品，因此確定1∶6為最佳徑高比。

2.2.4 工藝驗證試驗

精密稱取100 g積雪草粗粉，加20倍量的50%乙醇浸漬提取一次，一次2 h，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏靜置過夜，加水稀釋，得積雪草上樣液。平均分成3份，每份200 mL，上樣液濕法上樣加入到樹脂徑高比為1∶6的層析柱中，上樣流速為1 BV/h，水洗至無色，以4 BV 50%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，于60 ℃真空濃縮至干，稱其質(zhì)量，測定羥基積雪草苷含量，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，3次平行驗證RSD值小于2%，所以采用D101大孔吸附樹脂分離純化羥基積雪草苷的工藝重復性好，工藝穩(wěn)定可行，羥基積雪草苷含量由1.87%提高至27%以上，說明大孔吸附樹脂對羥基積雪草苷富集純化具有顯著效果。

表2 羥基積雪草苷純化工藝驗證

3 結(jié)論

試驗通過大孔吸附樹脂的方法對積雪草提取液進行分離純化研究。經(jīng)比較DM130、D-101、HPD417、AB-8、LX-60、HPD300六種型號樹脂靜態(tài)吸附率和解析率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D101大孔樹脂為積雪草總苷純化的最佳樹脂。通過動態(tài)吸附，對上樣體積、上樣流速、洗脫液濃度、洗脫液體積、樹脂徑高比進行了研究，試驗確定積雪草總苷純化最佳工藝為羥基積雪草苷上樣量19.8 mg/g，上樣流速1 BV/h，乙醇洗脫體積分數(shù)50%，乙醇洗脫體積4 BV，樹脂徑高比1∶6，在該條件下羥基積雪草苷的含量提高至27.4%。

試驗通過采用大孔吸附樹脂的方法對積雪草中羥基積雪草苷進行分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過大孔樹脂純化后羥基積雪草苷高度富集，雜質(zhì)減少，該純化工藝操作簡單，周期較短，樹脂可重復利用，降低了工藝成本，與其它純化方法相比，更利于大生產(chǎn)實際應用。