長孢洛德酵母菌致腹膜炎1例及生物學(xué)特性分析

吳小利，邵玲，翟明賀，劉麗文(遼寧省人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，沈陽110016)

長孢洛德酵母菌(Lodderomyceselongisporus，L.elongisporus)是以Jacomina Lodder博士名字命名的一種酵母菌，于1952年首次被描述為Saccharomyceselongasporus[1]，曾被認(rèn)為是念珠菌的一個(gè)分枝，但有研究表明其是一個(gè)不同的物種[2-3]。系統(tǒng)發(fā)育分析中長孢洛德酵母菌與近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、白念珠菌(C.albicans)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)和熱帶念珠菌(C.tropicalis)被劃分在一個(gè)分枝，是該分枝中唯一產(chǎn)生子囊孢子的物種[4]。2008年首次報(bào)道長孢洛德酵母菌引起人類菌血癥[5]，目前關(guān)于臨床感染的報(bào)道仍較少。由于該菌分離率低，形態(tài)易與其他酵母菌混淆，廣泛使用的鑒定方法Vitek 2和API 20C易發(fā)生誤判而影響抗真菌藥物的選擇，從而延誤患者的治療，增加患者負(fù)擔(dān)[6]。本研究通過從一位腎病患者透析液中檢出1株長孢洛德酵母菌，對該菌的微生物學(xué)特征、鑒定及藥物敏感性進(jìn)行分析，以期提高臨床對于該菌的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株分離自2019年遼寧省人民醫(yī)院1例腹膜透析相關(guān)性感染的56歲男性患者?；颊咴\斷依據(jù)2010年國際腹膜透析學(xué)會(huì)指南中關(guān)于腹膜透析相關(guān)性感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]?；颊呷朐旱?天及第7天2次腹透液經(jīng)血培養(yǎng)增菌培養(yǎng)均獲得相同分離菌。光滑念珠菌ATCC 15126、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258、白念珠菌ATCC 90028均購自上海寶錄生物公司，熱帶念珠菌編號201411菌株為國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)評菌株。

1.2主要試劑與儀器 血瓊脂培養(yǎng)基、科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(沈陽彥程生物公司)，SDA、PDA培養(yǎng)基(天津金章公司)，革蘭染色液(快速)、抗酸染色液(珠海貝索公司)，SensititreTMYeastONE(美國Thermo公司)，真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)；LEICA DM750光學(xué)顯微鏡(德國LEICA公司)，0.45%鹽水、Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、真菌鑒定卡(Vitek?2 YST)(法國生物梅里埃公司)，質(zhì)譜樣本處理液、microflexTMLRF質(zhì)譜分析儀(Bruker Daltonics公司)。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3分離菌株的培養(yǎng)與鑒定 將分離菌在血平板、科瑪嘉顯色平板及PDA平板上35 ℃培養(yǎng)，分別觀察24 h、48 h、72 h、96 h菌落形態(tài)；取血平板上培養(yǎng)24 h菌落涂片并采用結(jié)晶紫染色和革蘭染色后觀察鏡下形態(tài)；取血平板上培養(yǎng)24 h菌落置于裝有0.5 mL新鮮血清試管中，35 ℃培養(yǎng)2 h，制作濕片鏡下觀察芽管形成情況，用白念珠菌ATCC 90028作對照；取血平板上培養(yǎng)48 h菌落于0.45%鹽水中制備3.0麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，采用Vitek?2 YST卡在Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；同時(shí)取血平板上培養(yǎng)48 h單個(gè)菌落涂布靶板，自然干燥后加入1 μL 70%甲酸覆蓋點(diǎn)樣孔，自然風(fēng)干后，加1 μL質(zhì)譜樣本處理液，自然風(fēng)干后上基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀進(jìn)行鑒定并依據(jù)儀器說明進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4基因序列分析 收集血平板上培養(yǎng)48 h菌落，按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。參照文獻(xiàn)[8]合成真菌通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系30 μL，包括2×Taq plus mix 15 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳并對目的條帶進(jìn)行回收(主要試劑：溶膠液、磁珠、ddH2O、80%乙醇)，采用Sanger法在ABI 3730XL設(shè)備上進(jìn)行測序，由北京睿博興公司完成。將測序序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析。

1.5聚類分析 建立分離菌長孢洛德酵母菌的數(shù)據(jù)庫，通過MALDI Biotyper 3.1軟件與白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、近平滑念珠菌5種常見酵母菌及庫內(nèi)已知的3株L.elongisporus進(jìn)行聚類分析，得出系統(tǒng)樹狀圖。

1.6藥物敏感性分析 取SDA平板上培養(yǎng)24 h菌落并制備0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，?0 μL菌懸液加入YeastONE真菌接種肉湯中混勻，真菌藥敏板每孔加入混勻后的YeastONE真菌接種肉湯100 μL，密封后于35 ℃培養(yǎng)箱中溫育24 h后進(jìn)行結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1長孢洛德酵母菌培養(yǎng)特性、菌落形態(tài) 分離菌株在血平板和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～96 h呈白色光滑菌落；在科瑪嘉顯色平板上培養(yǎng)24 h為白色小菌落，48～96 h逐漸顯色，最終呈藍(lán)綠色菌落。見圖1。血平板上生長24 h后經(jīng)芽管生成試驗(yàn)未見芽管形成，革蘭染色和結(jié)晶紫染色鏡下呈現(xiàn)卵圓形孢子。長孢洛德酵母菌在科瑪嘉顯色平板上呈藍(lán)綠色菌落，顏色介于白念珠菌的淡藍(lán)綠色和暗藍(lán)、藍(lán)灰色的熱帶假念珠菌之間，與近平滑念珠菌、克柔念珠菌及光滑念珠菌的紫色系列明顯不同，見圖2。

注：a1～a4，為血平板；b1～b4，為科瑪嘉顯色平板；c1～c4，為PDA平板。

注：a，長孢洛德酵母菌；b，克柔念珠菌；c，近平滑念珠菌；d，光滑念珠菌；e，白念珠菌；f，熱帶念珠菌。

2.2Vitek 2和MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 Vitek 2鑒定分離菌結(jié)果為無名念珠菌(C.famata)，MALDI-TOF MS鑒定分離菌為長孢洛德酵母菌(得分為2.10)。

2.3ITS rRNA基因序列分析結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger法測序長度為565 bp，將序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，相似性排在前3位的均為L.elongisporus(登錄號：JN606251.1、KF959855.1和AY391845.1)，相似性分別為99.47%、99.46%和99.46%。

2.4聚類分析結(jié)果 所選6種酵母菌分為2類，其中長孢洛德酵母菌與白念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分類中，而長孢洛德酵母菌與近平滑念珠菌在同一亞類中，白念珠菌與熱帶念珠菌在另外一個(gè)亞類中。分離菌與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中已知3株參考菌株在同一個(gè)聚類圖分枝中，但不是同一株菌。見圖3。

注：*為分離菌。

2.5藥敏結(jié)果 分離菌株對檢測藥物的MIC分別為米卡芬凈(0.015 μg/mL)、卡泊芬凈(0.03 μg/mL)、5-氟胞嘧啶(0.12 μg/mL)、泊沙康唑(0.03 μg/mL)、伏立康唑(0.03 μg/mL)、伊曲康唑(0.12 μg/mL)、阿尼芬凈(0.03 μg/mL)、氟康唑(0.5 μg/mL)、兩性霉素B(0.25 μg/mL)。

3 討論

長孢洛德酵母菌在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，易與常見菌白念珠菌及熱帶念珠菌混淆，后二者在顯色培養(yǎng)基上分別呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色和暗藍(lán)、藍(lán)灰色菌落。其中，長孢洛德酵母菌和白念珠菌的鑒別在無其他輔助設(shè)備使用的情況下可通過芽管試驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分，光學(xué)顯微鏡下白念珠菌有芽管生長，而長孢洛德酵母菌無芽管生長。應(yīng)用Vitek或API鑒定時(shí)，長孢洛德酵母菌易被誤鑒定為近平滑念珠菌[5-6,9-11]，而本研究菌株經(jīng)Vitek鑒定為無名念珠菌。采用MALDI-TOF MS或測序進(jìn)一步明確鑒別為長孢洛德酵母菌。但國內(nèi)很多中、小型微生物實(shí)驗(yàn)室，由于MALDI-TOF MS或測序并未得到廣泛使用，僅根據(jù)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的菌落顏色及Vitek表型鑒定結(jié)果，會(huì)造成對長孢洛德酵母菌的漏診及誤診。本研究通過MALDI Biotyper 3.1軟件對分離菌增建菌株庫，與5種酵母菌(包括白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、東方伊薩酵母)參考菌株進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)長孢洛德酵母菌與白念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌在同一分枝中，這與Diezmann等[12]的發(fā)現(xiàn)相一致。通過MSP樹狀圖增建菌株庫可提高實(shí)驗(yàn)室的檢測能力。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長孢洛德酵母菌可引起人類血流感染[5,13]、導(dǎo)管相關(guān)血流感染[9,11]以及心內(nèi)膜炎[10]。本研究中患者3年前診斷為多發(fā)性骨髓瘤，經(jīng)數(shù)次化療，長期激素、免疫抑制劑及廣譜抗菌藥物治療導(dǎo)致患者免疫功能降低，機(jī)體處于免疫抑制及菌群失調(diào)狀態(tài)，進(jìn)而造成真菌侵襲性感染的機(jī)會(huì)增加。該菌易感因素尚不明確，可能與惡性腫瘤、免疫抑制劑的長期使用、留置導(dǎo)管等有關(guān)。目前，國際上關(guān)于長孢洛德酵母菌的治療尚無統(tǒng)一方案，藥敏試驗(yàn)方法也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)及藥敏折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)。檢索報(bào)道的7例病例中4例死亡、3例治愈的患者雖治療方案不同，但均使用了棘白菌素類藥物[13]。但由于技術(shù)手段的局限性而錯(cuò)誤將長孢洛德酵母菌鑒定為近平滑念珠菌時(shí)，因棘白菌素類藥物對近平滑念珠菌作用較弱，可能會(huì)造成臨床診斷及治療的延誤，從而給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及增加死亡率。由于現(xiàn)有鑒定技術(shù)可能存在的不足，臨床感染長孢洛德酵母菌的檢出率被低估。因此，提高微生物實(shí)驗(yàn)室對該菌的識別能力和臨床對該菌感染的重視度十分重要。