生物傳感器識別元件的種類及其在臨床檢驗中的研究進(jìn)展*

張澤，張穎聰，于洪偉，榮勝忠，高宏民，常東(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗科，上海201399)

近年來，生物傳感器廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病篩查等方面[1-2]，構(gòu)建性能優(yōu)異的生物傳感器是目前研究人員一直追尋的目標(biāo)。生物傳感器由識別元件和信號轉(zhuǎn)換器組成，能夠?qū)⑻囟悠分写郎y組分特異性識別并轉(zhuǎn)換為可讀取的信號進(jìn)行輸出。識別元件又稱為目標(biāo)受體，是生物傳感器的重要組成部分，其性能優(yōu)良程度直接關(guān)系到傳感器的選擇性能。經(jīng)典的識別元件多為從生物體內(nèi)分離出的酶或抗體等，研究時間較早且研究范圍也較為廣泛。然而考慮到快速診斷、提高穩(wěn)定性和成本效益等方面的需要，研究人員逐步研發(fā)新的識別元件來提高傳感器的識別性能，如噬菌體、適配體等，這不僅綜合提高了傳感器的分析性能，而且還拓展了生物傳感器的應(yīng)用范圍，促進(jìn)了生物傳感器向?qū)嶋H產(chǎn)品檢測的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。目前，生物傳感器已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究中，如體內(nèi)生物小分子檢測、病原微生物檢測[3]、藥物檢測[4]和疾病標(biāo)志物檢測[5]。本文將對生物傳感器識別元件的種類及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

生物傳感器中的識別元件要對目標(biāo)物具有穩(wěn)定且特異的識別能力。如表1所示，目前識別元件可分為經(jīng)典識別元件，如酶、抗體、DNA、細(xì)胞和組織，以及新型識別元件，如核酸適配體，分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)、噬菌體、親合體和脫氧核酶[6]。

表1 生物傳感器中識別元件的特點

1 經(jīng)典識別元件

自1962年第1個葡萄糖生物傳感器[7]問世以來，以酶作為識別元件的生物傳感器不斷發(fā)展。隨著研究的進(jìn)一步深入，基于抗原抗體特異性識別、核苷酸堿基互補配對原理發(fā)展了多種類別的生物傳感器。依據(jù)識別元件的類別可將生物傳感器分為酶傳感器、免疫傳感器和DNA傳感器等，這些傳感器所涉及到的經(jīng)典識別元件主要有以下幾種：

1.1酶 在酶生物傳感器的構(gòu)建中，主要有2個應(yīng)用方面，一種是利用酶對分析物進(jìn)行催化代謝，除了早期葡萄糖氧化酶被用作敏感的識別元件外，一些檢測生物小分子的酶也逐漸被應(yīng)用于固化酶膜的構(gòu)建，例如葡萄糖脫氫酶、尿酸酶等；另一種是利用某些化合物能夠抑制酶的活性所構(gòu)建的傳感器，典型的代表是對農(nóng)藥含量的檢測，Zhang等[8]利用乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)、復(fù)合納米材料和聚合物構(gòu)建安培型生物傳感器檢測三氯磷酸酯和馬拉硫磷這2種有機磷農(nóng)藥。

酶作為識別元件其操作簡便，特異性好。缺點在于酶的純化成本較高且費時，穩(wěn)定性欠佳。目前該領(lǐng)域的進(jìn)展方向是合成納米酶，由于納米酶價格便宜且穩(wěn)定性好適合構(gòu)建納米酶傳感器陣列，以獲得較高的檢測通量。

1.2抗體 抗體是生物傳感器中應(yīng)用范圍最廣的識別元件，根據(jù)其制備方法和原理，可分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。目前，對于免疫傳感器的研究非常廣泛，如蛋白質(zhì)、毒素和生物標(biāo)志物等方面的檢測[9]。隨著免疫傳感器的不斷發(fā)展，更多信號放大策略被應(yīng)用其中。研究人員在構(gòu)建基于免疫復(fù)合物檢測的生物傳感器中引入“法拉第籠概念”[10]，與傳統(tǒng)的三明治式免疫分析相比，其靈敏度顯著提升。

但抗體作為識別元件其檢測目標(biāo)有限、成本高、穩(wěn)定性欠佳。目前，利用生物、化學(xué)、基因等方法已經(jīng)實現(xiàn)合成雙官能團(tuán)抗體，這類抗體具有2個不同的抗原結(jié)合區(qū)，能同時識別2種抗原，未來有望應(yīng)用于新型免疫生物傳感器。

1.3DNA DNA傳感器也是研究較為廣泛的一種，DNA作為識別元件特異性較強。通常依靠堿基互補配對形成穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，通過換能器將信號輸出，實現(xiàn)對目標(biāo)核酸特異性識別檢測[11-12]。DNA傳感器又稱為基因傳感器，針對疾病相關(guān)基因的準(zhǔn)確檢測具有重要意義。隨著研究的不斷深入，核酸傳感器構(gòu)建策略更加復(fù)雜。Zeng等[13]構(gòu)建了一種DNA四面體納米結(jié)構(gòu)，其檢測靈敏度到降低至1 fm，未來有望利用這種DNA四面體探頭對疾病相關(guān)DNA、miRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行即時定量檢測。

然而，DNA識別元件在檢測過程中存在雜交假象，堿基錯配等現(xiàn)象。這些都會對DNA傳感器的靈敏度、重現(xiàn)性等性能產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步提高。

1.4細(xì)胞 細(xì)胞作為生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，當(dāng)受到外界刺激后，產(chǎn)生的電信號經(jīng)過放大處理可對待測物質(zhì)進(jìn)行檢測。雖然細(xì)胞作為識別元件從監(jiān)測細(xì)胞生理性能、重金屬離子動態(tài)監(jiān)測到藥物篩選等方面被廣泛研究，但是仍有一些因素限制了細(xì)胞傳感器的進(jìn)一步發(fā)展，如再生性和可供選擇的細(xì)胞種類有限等，仍有許多問題有待解決。

1.5組織 組織傳感器通常是以動植物組織薄片作為傳感器的識別元件，在電極表面形成生物敏感膜，利用組織中的酶對底物特異性催化，其工作原理與酶傳感器相似，但組織中的酶活性更高，固定化程度更好，對于一些催化反應(yīng)不明確以及生物催化途徑不清楚的反應(yīng)無法直接用酶電極，只能應(yīng)用組織電極。然而，組織的敏感度不夠理想、反應(yīng)時間較長、構(gòu)建電極過程復(fù)雜。

1.6微生物 1975年Divies研制了第一支微生物傳感器，開辟了生物傳感器的又一新領(lǐng)域，早期的微生物傳感器多利用細(xì)菌菌體作為識別元件，通過細(xì)胞固定化技術(shù)將活體微生物固定在電極上形成微生物膜，利用微生物的呼吸作用或菌體內(nèi)酶的催化作用，對反應(yīng)體系中消耗的溶解氧含量或產(chǎn)生電活性物質(zhì)來間接實現(xiàn)待測物質(zhì)的定量檢測，通常分為呼吸活性型和代謝活性型兩種微生物傳感器，微生物作為識別元件成本低，壽命長，但是由于菌體內(nèi)含有多種酶，使傳感器的選擇性和靈敏度受到限制，且底物需要通過細(xì)胞壁擴散，響應(yīng)時間較長。目前有研究通過加入特定的抑制劑能夠克服微生物的選擇性問題，同時開發(fā)新技術(shù)提高固化效率，育種高效耐毒的微生物是該領(lǐng)域的另一個研究方向。

2 新型識別元件

近年來，出于對高選擇性、穩(wěn)定性、成本效益等方面的考慮，人們開始探索新型識別元素用于傳感器的構(gòu)建，力求在靈敏度、選擇性、檢測限和信噪比等方面提高生物傳感器的綜合分析能力。目前研究較多的新型識別元件有以下幾種。

2.1核酸適配體 核酸適配體是一種經(jīng)體外合成和篩選的寡核苷酸序列，自身經(jīng)過卷曲和折疊形成具有一定功能的特定三級結(jié)構(gòu)，能夠與相應(yīng)的蛋白質(zhì)、離子或小分子物質(zhì)通過鍵絡(luò)合形成配合物。其目標(biāo)物有病毒顆粒、病原菌、細(xì)胞黏附分子等[14]，應(yīng)用范圍廣泛，在功能上類似于抗體，有化學(xué)抗體之稱，但適配體熱穩(wěn)定性好、批間差異小、成本低、適合低免疫原性抗原。 適配體的研發(fā)為生物傳感器的制備提供了一個新的檢測平臺。

由于核酸適配體在人為環(huán)境中合成，與生理環(huán)境不同，存在一些缺點，如結(jié)構(gòu)剛性不如抗體，易被核酸酶降解、親和力不穩(wěn)定等缺點。但作為一種新型識別元件，核酸適配體具有巨大的應(yīng)用前景，未來有許多研究工作等待我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

2.2MIP MIP是一種在結(jié)合位點和化學(xué)空間結(jié)構(gòu)與模板分子或印跡分子相匹配的高分子聚合物，制備這種聚合物的方法稱為分子印跡技術(shù)。分子印跡的理論來源于免疫學(xué)，1972年Wulff小組首次報道制備出MIP[15]。經(jīng)過幾十年的研究，該技術(shù)趨于成熟。MIP具有高耐熱性、高耐化學(xué)和機械性，可以重復(fù)使用，且成本較低等優(yōu)點，近些年來也逐漸應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建中。

這種新型高分子仿生材料的特異性功能類似于抗原-抗體相互作用，因此在替代生物抗體方面具有巨大潛力，被稱為人工抗體。但是MIP也存在一些局限性，如制作工藝較為復(fù)雜、耗時較長、模板分子滲漏等不足，因此未來在免疫分析、模擬酶和納米生物傳感器等方面也會面臨巨大挑戰(zhàn)。

2.3噬菌體 噬菌體(phages)是一類能夠感染多種微生物的病毒的總稱，通過受體結(jié)合蛋白能夠?qū)?xì)菌表面的特異性受體進(jìn)行識別，每種噬菌體的靶宿主是一組特異的細(xì)菌，其作為識別元件可以在傳感器上構(gòu)建捕獲感應(yīng)層，噬菌體的擴增和細(xì)菌內(nèi)容物的釋放可用作分析信號。噬菌體作為識別元件具有特異性高、韌性強和儲存時間長等優(yōu)點，其應(yīng)用范圍逐漸擴展。Chai等[16]利用無線磁彈性(ME)生物傳感器直接檢測新鮮農(nóng)產(chǎn)品中的鼠傷寒沙門氏菌。Tolba等[17]利用含有噬菌體的電化學(xué)生物傳感器(內(nèi)溶酶菌CBD500噬菌體)檢測牛奶中的李斯特菌。

2.4親合體 親合體(affibodies)是一種介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類多種氨基酸組成的多肽，具有體積較小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可人工合成等特點，其結(jié)合位點與抗體相似，但不易在體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)。在生物樣本檢測中，親合體也可以作為受體，與生物傳感器相結(jié)合[18]，這將是一個很有潛力的研究領(lǐng)域。目前親合體廣泛應(yīng)用于成像、診斷和治療等領(lǐng)域，但其作為生物傳感器識別元件的作用才剛剛起步，未來親合體憑借對目標(biāo)分析物較高的特異性親和能力，將會展現(xiàn)出巨大潛力。

2.5脫氧核酶 脫氧核酶(DNAzymes)是一種利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)合成的具有催化功能的單鏈DNA片段。因為其具有高效的結(jié)構(gòu)識別能力和催化活性，近年來被逐漸開發(fā)用作傳感器的識別元件。Huang等[19]研制了一種基于DNAzyme擴增的無標(biāo)簽比色檢測凝血酶的傳感器。 Zhao等[20]開發(fā)了一種基于DNAzyme識別元件的多功能擴增生物傳感平臺，用于檢測核酸、蛋白質(zhì)和酶活性。

3 生物傳感器在臨床檢驗中的應(yīng)用進(jìn)展

由于生物傳感技術(shù)靈敏度較高并且儀器設(shè)備易小型化，目前被越來越多地用于復(fù)雜體系的線性分析和檢測中，特別是針對臨床檢驗中標(biāo)本干擾物較多，以及床旁檢測的快速發(fā)展的需要，生物傳感器具有良好的發(fā)展前景?；谄錂z測信號轉(zhuǎn)換原理，生物傳感器通常被分為電化學(xué)、光學(xué)和壓電生物傳感器。其中，電化學(xué)生物傳感器是基于電位、電流或電阻轉(zhuǎn)換的原理檢測電活性物質(zhì)的產(chǎn)生或消耗，從而間接反映待測物濃度的大小。光學(xué)傳感器是利用分析物與換能器在吸收、發(fā)光、熒光、反射率和表面等離子體共振(SPR)等光學(xué)特性方面相互作用來實現(xiàn)定量或定性的檢測。壓電傳感器采用在外加交流電場作用下產(chǎn)生的共振，利用電氣元件和其他設(shè)備將待測壓力轉(zhuǎn)換成電量，從而進(jìn)行相關(guān)檢測工作。目前已經(jīng)研發(fā)了一些針對臨床檢驗的生物傳感器，其中一些想法的提出能夠有效提高檢測的靈敏度和傳感平臺的穩(wěn)定性，近年來生物傳感器在臨床檢驗方面研究的最新情況如下(表2)。

表2 生物傳感器應(yīng)用于臨床檢驗方面研究的相關(guān)參數(shù)

3.1生化免疫指標(biāo)檢測 通過對人體內(nèi)生化免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測，對疾病的篩查、診斷以及治療具有重要的臨床應(yīng)用價值，最早研制的生物傳感器就是針對血液中葡萄糖進(jìn)行的檢測，目前商品化的便攜式血糖儀已經(jīng)廣泛引用于臨床血糖篩查，且家用式血糖生物傳感器占據(jù)全球巨大市場，其基本原理就是利用試紙條中固定的酶與待測血液中的葡萄糖反應(yīng)所產(chǎn)生的電流量進(jìn)行測定，主要的方法有葡萄糖氧化酶電極測量法和葡萄糖脫氫酶電極測量法等。此外，在世界范圍內(nèi)心腦血管疾病是導(dǎo)致殘疾和死亡的重要原因之一，對特定生化指標(biāo)檢測有助于識別高危風(fēng)險患者，目前已經(jīng)有多種方法應(yīng)用于臨床檢驗，生物傳感器也被考慮用于心肌標(biāo)志物等的快速檢測。Cho等[21]構(gòu)建了一種熒光免疫生物傳感器可同時檢測cTnI、CK-MB和肌紅蛋白，重復(fù)性良好，抗干擾性強且沒有樣品基質(zhì)造成的偽影。另外，其他的一些生化指標(biāo)也逐漸被檢測，Yu等[22]將尿酸氧化酶(UOx)固定于石墨烯量子點(GQDs)修飾的玻碳電極上，該新型酶生物傳感檢測平臺能夠靈敏地檢測尿酸。Zou等[23]將銀團(tuán)簇的特性和雜化鏈反應(yīng)(HCR)相結(jié)合，構(gòu)建信號放大策略，利用ECL方法對組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)活性分析和抑制劑評價。Ojeda等[24]提出構(gòu)建一次性電化學(xué)免疫傳感器，利用競爭免疫分析法來檢測血清和尿液樣本中的雌二醇。截止目前，越來越多的生化指標(biāo)可以逐步應(yīng)用生物傳感器來進(jìn)行快速檢測。

3.2病原體檢測 當(dāng)人體免疫力降低時，如果遭受到病原體的侵襲會引發(fā)各種疾病，盡早對致病性的病原體進(jìn)行檢測，能夠有效查出病因并指導(dǎo)臨床合理用藥。研究人員探索利用生物傳感器對病原菌進(jìn)行檢測，Zhang等[25]將單鏈DNA探針固定于雜化膜上，構(gòu)建無標(biāo)記DNA電化學(xué)生物傳感器檢測肺炎克雷伯菌。Yi等[10]利用針對鼠傷寒沙門氏菌(S. typh)的適配體構(gòu)成具有識別功能的復(fù)合分子識別元件，來實現(xiàn)檢測S. typh的目的。Safavieh等[26]研制了定量檢測大腸桿菌檢測的微流體電化學(xué)生物傳感器。Babamiri等[27]構(gòu)建MIP靈敏檢測人體免疫缺陷病毒(HIV)，利用HIV適配體作為模板，寡核苷酸鏈作為探針，未來該方法可推廣用于檢測其他DNA生物標(biāo)志物。

3.3腫瘤標(biāo)志物檢測 腫瘤標(biāo)志物是一類由腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)所產(chǎn)生或是人體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)所產(chǎn)生的物質(zhì)，主要可分為胚胎抗原、組織特異性抗原、糖蛋白、miRNA等。 確定血液或組織中腫瘤標(biāo)志物的水平對癌癥篩查至關(guān)重要。對腫瘤標(biāo)志物的快速準(zhǔn)確檢測對疾病的診療、監(jiān)測具有重要意義。目前，已經(jīng)研發(fā)了多種可以檢測不同種類標(biāo)志物的生物傳感器。Cao等[28]構(gòu)建了競爭型檢測前列腺特異性抗原(PSA)的適配體傳感器，借助葡萄糖氧化酶(GOD)催化葡萄糖原位生成H2O2，實現(xiàn)多重放大效應(yīng)提高該適配體傳感器的靈敏度和選擇性。Mo等[29]利用4-巰基苯基硼酸(MPBA)親和三明治電化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器來檢測甲胎蛋白(AFP)，是一種新穎、簡單、普遍適用的糖蛋白印跡方法。腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測能夠提高檢測的準(zhǔn)確率，Babamiri等[30]將針對CA125和CA15-3兩種腫瘤標(biāo)志物的Ab1固定于Fe3O4@SiO2/聚合物復(fù)合物構(gòu)建的放大平臺上，成功構(gòu)建多元超敏ECL免疫傳感器檢測。近些年來對于miRNA與腫瘤之間相關(guān)性的研究成為熱點，對其準(zhǔn)確檢測將會對癌癥的診斷和靶基因的治療具有重要臨床應(yīng)用價值，F(xiàn)eng等[31]利用絲網(wǎng)印刷碳電極多通路比率分析檢測miRNA-21和miRNA-141。未來生物傳感器發(fā)展方向是在同一檢測平臺固定多種針對不同腫瘤標(biāo)志物的識別元件，實現(xiàn)高通量腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測。除此之外還有多種生物傳感器被研究應(yīng)用于臨床檢驗診斷，如急性白血病臨床免疫分型的免疫傳感陣列，早期檢測設(shè)備植入后的細(xì)胞因子；藥物敏感性及藥物濃度生物傳感器的研制等。

4 總結(jié)

本文介紹了生物傳感器中兩大類識別元件及其在臨床檢驗中的研究進(jìn)展，對不同識別元件的結(jié)構(gòu)、應(yīng)用范圍、優(yōu)勢和劣勢進(jìn)行了系統(tǒng)介紹。盡管經(jīng)典的識別元件早期已經(jīng)廣泛引領(lǐng)了生物傳感器的構(gòu)建，但現(xiàn)在仍有較大的發(fā)展活力。隨著人們對生物傳感器這一科學(xué)領(lǐng)域興趣的不斷提升，為了開發(fā)更加快速、有效、微型化的生物傳感檢測平臺，逐漸通過人工合成、體外篩選出能夠特異性識別目標(biāo)物的新型識別元件。目前，新型生物傳感識別元件仍然在發(fā)展中，利用基因工程技術(shù)合成特異性蛋白以及核糖體RNA探針的應(yīng)用是另外具有發(fā)展前景的研究方向，未來針對該領(lǐng)域的工作重點主要是在檢測復(fù)雜基質(zhì)中如何提高生物傳感器識別元件對目標(biāo)物的特異性捕獲能力。同時，還要增強識別元件對抗外界干擾的能力，增加識別元件的耐受性能，延長傳感器的使用壽命。還要利用納米材料為生物傳感器的構(gòu)建提供新的機遇，不斷探索識別元件與納米材料相結(jié)合的新性能，制造更加適用于臨床的生物傳感器。目前，許多生物傳感器的原型還沒有達(dá)到商業(yè)化階段，成果轉(zhuǎn)化需要進(jìn)一步推進(jìn)。希望未來在臨床診斷、食品分析、過程控制和環(huán)境監(jiān)測等方面將會具有更為廣闊的應(yīng)用前景。