模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性及超微結(jié)構(gòu)的影響

陳正陽(yáng),孫培鳴,張 濤,徐冰心,孫宏偉,司少艷,周金蓮,楊建武,崔 彥

隨著我國(guó)載人航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，航天醫(yī)學(xué)研究備受關(guān)注[1-2]。研究證實(shí)，失重環(huán)境顯著影響人體的生理病理過(guò)程，這同時(shí)為我們研究腫瘤的生物學(xué)行為提供了一種新的思路[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，失重對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究主要集中在甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等；研究表明，微重力環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的生理功能和超微結(jié)構(gòu)有重要影響[4-7]。胃癌是世界第四位的常見(jiàn)癌癥，也是第二位的癌癥死亡原因[8]。本課題組前期進(jìn)行模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞代謝組學(xué)影響的研究，發(fā)現(xiàn)微重力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(the rotary cell culture system，RCCS)能夠顯著影響人HGC-27胃癌細(xì)胞脂類物質(zhì)代謝，對(duì)HGC-27胃癌細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生顯著影響[9]。本實(shí)驗(yàn)研究RCCS模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和相關(guān)蛋白及超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在進(jìn)一步豐富航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論，為航天環(huán)境及失重暴露后胃癌機(jī)制探討和防治提供研究思路。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 人HGC-27胃癌細(xì)胞系(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，微載體Cytodex-3(Sigma, USA)，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Synthecon, USA)，透射電鏡(FEI Tecnai Spirit 120 kv USA)，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur, BD, USA)，酶標(biāo)分析儀(RT-6100, Rayto, USA)，鼠單抗Bcl-2，鼠單抗Fas，兔多抗Cyclin B1，鼠單抗Cyclin D1，小鼠單抗β-Actin，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗。

1.2人HGC-27胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco, USA)、10%胎牛血清(Gibco, USA)、1% 100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素(Gibco, USA)配制完全培養(yǎng)基，將人HGC-27胃癌細(xì)胞傳代后置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液3次。選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好、處于4～10代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為模擬微重力組(SMG)和正常重力對(duì)照組(NG)。SMG組細(xì)胞置于RCCS模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)；NG組細(xì)胞置于正常重力環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3建立人HGC-27胃癌細(xì)胞RCCS微載體培養(yǎng)體系 每個(gè)HARV(50 ml)底部有一層有機(jī)硅膜，將配置好的完全培養(yǎng)基和250 mg Cytodex-3微載體充分混勻后注入HARV。計(jì)數(shù)人HGC-27胃癌細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)HARV中加入7×106個(gè)細(xì)胞。待HARV中加入的完全培養(yǎng)基接近充滿時(shí)，用塞子封閉注入口。用吸取完全培養(yǎng)基和空氣的5 ml注射器排空HARV中的氣泡，確認(rèn)排盡氣泡后用乙醇棉球消毒塞子外表面。把HARV連接到RCCS系統(tǒng)中并置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱，HARV轉(zhuǎn)速設(shè)置為8 r/min。2組細(xì)胞在RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)間為1、3 d。

1.4樣本采集 用移液管將HARV中的細(xì)胞-微載體-完全培養(yǎng)基混合液體轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中并靜置3 min，待細(xì)胞-微載體復(fù)合物沉淀后棄去含有完全培養(yǎng)基的上清液。加入PBS，并用移液管吹洗細(xì)胞-微載體復(fù)合物，充分吹洗后，棄去上清液。重復(fù)上述過(guò)程3次。隨后加入0.25%胰酶4 ml，置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱消化3 min。終止胰酶的消化后，1000 r/min離心5 min。用70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾并1000 r/min 離心5 min后，獲得SMG組人HGC-27胃癌細(xì)胞。NG組細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基、PBS沖洗、加入0.25%的胰酶3 ml消化和1000 r/min離心5 min后，獲得人HGC-27胃癌細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將培養(yǎng)1、3 d的NG組和SMG組細(xì)胞用PBS吹洗2次，1000 r/min離心5 min。配置100 μl的細(xì)胞懸液并加入到96孔板中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(37℃, 5%CO2)。置于培養(yǎng)箱中24 h。向96孔板中加入CCK-8溶液10 μl。置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

1.6.1細(xì)胞周期檢測(cè)：2組細(xì)胞經(jīng)消化離心后，置于預(yù)冷75%乙醇中，然后置于4℃環(huán)境下(24 h)。把固定好的細(xì)胞用預(yù)冷PBS 吹洗2次，2000 r/min離心5 min，加入200 μl PBS，轉(zhuǎn)移至流式管中。每個(gè)流式管加入100 μl RNA酶，在37℃水浴消化30 min，加入PI溶液100 μl至終濃度100 μg/ml并用錫箔紙包住，避光4℃染色30 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.6.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)：2組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化離心后用PBS吹洗2次，1000 r/min離心5 min。每個(gè)流式管中加入106個(gè)細(xì)胞，并用預(yù)冷的細(xì)胞著色緩沖液吹洗，接著用1×106/ml的Annexin V溶液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC溶液，混勻后在4℃環(huán)境下避光放置15 min。最后加入10 μl PI溶液，混勻后在4℃環(huán)境下避光放置5 min；然后上機(jī)檢測(cè)。

1.7Western Blot法檢測(cè)周期蛋白(Cyclin D1和CyclinB1)和凋亡相關(guān)蛋白(Fas和Bcl-2)表達(dá) 按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)、10 μl磷酸酶抑制劑，搖勻置于冰上。每管加入80 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解完后，用冷凍離心機(jī)12 000×g離心5 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到0.5 ml的EP管中，置于-20℃環(huán)境中保存。用BCA試劑盒(碧云天，中國(guó))進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。將事先制備好的SDS-PAGE膠加入電泳槽中，在各膠孔中分別加入10 μl待檢測(cè)樣本，當(dāng)loading buffer到達(dá)分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。然后轉(zhuǎn)膜時(shí)，夾的黑面對(duì)槽的黑面；夾的白面對(duì)槽的紅面，將其放入轉(zhuǎn)膜槽中，并排除氣泡，在電壓為80 V下，轉(zhuǎn)膜60 min。在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用含5%的脫脂奶粉TBST室溫下封閉1 h，洗滌后加入一抗(Proteintech 公司，美國(guó))，室溫下?lián)u床孵育1～2 h。在一抗孵育結(jié)束后，TBST洗滌3次，每次10 min。同樣的方法加入和處理二抗。將處理好的膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，然后將發(fā)光液A液、B液按1∶1配好，均勻地滴在膜上。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)免疫印跡。

1.8透射電鏡觀察細(xì)胞器的變化 NG組和SMG組的細(xì)胞消化離心后獲得單細(xì)胞團(tuán)。向單細(xì)胞團(tuán)中加入2.5%戊二醛直至沒(méi)過(guò)離心管，并在室溫下固定2 h。用移液器棄去2.5%戊二醛，接下來(lái)加入1%鋨酸，并在室溫下固定2 h。用50%、70%、90%、100%乙醇、100%丙酮依次脫水。樹(shù)脂包埋、切片，最后用透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖比較 與NG組相比，SMG組第1、3天人HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同時(shí)相的SMG組細(xì)胞增殖能力明顯不同，與第1天相比，SMG組人HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖能力在第3天后顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.2細(xì)胞周期 與NG組相比，SMG組第1天和第3天G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，而G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組S期細(xì)胞比例在第1天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第3天后SMG組S期細(xì)胞比例較NG組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2A、2B。與NG組相比，SMG組第 1、3 天Cyclin D1和Cyclin B1表達(dá)水平顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2C。

圖2 模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞周期的影響

2.3細(xì)胞凋亡 與NG組相比，第1、3天SMG組Fas表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2表達(dá)水平顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NG組相比，SMG組第1、3天凋亡細(xì)胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) NG組第1天和第3天胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)、細(xì)胞膜、核仁均正常；SMG組第1天細(xì)胞器的變化與NG組第1天的類似。SMG組第3天細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、線粒體形態(tài)、細(xì)胞膜、核仁正常，但胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹明顯、胞質(zhì)中細(xì)胞空泡結(jié)構(gòu)明顯增加，其中，白色箭頭所指的分別是腫大的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖4。

圖4 模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

HGC-27細(xì)胞是日本學(xué)者Tadaatsu Akagi于1973年從1例未分化胃癌患者切除的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶取材所建立的人未分化胃癌細(xì)胞系，細(xì)胞呈多角形或短梭形，以單層的形式貼壁生長(zhǎng)，倍增時(shí)間為17 h；從形態(tài)上看，HGC-27細(xì)胞缺乏明顯的腺癌細(xì)胞特征，鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)充滿黏液，細(xì)胞核被擠壓一邊并呈“印戒”樣；該細(xì)胞中三磷腺苷、乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性較高。研究表明，HGC-27胃癌細(xì)胞是一種理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RCCS模擬微重力顯著影響了人HGC-27胃癌細(xì)胞的生理功能，SMG組第1、3天HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例增加，Cyclin D1和Cyclin B1表達(dá)減少。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用RCCS或RPM來(lái)模擬微重力時(shí)，CDK1、CDK2、CDK4、CCND1和CCNB1的mRNA在DLD-1大腸癌細(xì)胞表達(dá)減少[11-12]。姜楠等[13]研究了失重對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，其研究結(jié)果顯示，RCCS模擬微重力環(huán)境下人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞內(nèi)次級(jí)溶酶體明顯增多，G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞凋亡增加。Cyclin D1和Cyclin B1在G1/S期和在G2/M期轉(zhuǎn)換中起著重要作用。Cyclin D1是CCND1編碼的一種蛋白，具有促進(jìn)G1到S期轉(zhuǎn)化的作用；Cyclin B1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白，主要調(diào)節(jié)G2到M期的轉(zhuǎn)化，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)存在Cyclin B1表達(dá)異常，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)[14]。結(jié)合文獻(xiàn)認(rèn)為在RCCS微重力環(huán)境中，HGC-27胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin B1表達(dá)減少，致使G2/M期阻滯，細(xì)胞增殖能力降低，而S期細(xì)胞比例增加可能與實(shí)驗(yàn)中失重暴露時(shí)間過(guò)短有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)第1、3天后，SMG組人HGC-27胃癌細(xì)胞的凋亡顯著增加，凋亡蛋白Fas表達(dá)水平顯著增加；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則顯著減少，并且隨RCCS模擬失重培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，人HGC-27胃癌細(xì)胞的凋亡更顯著。表明人HGC-27胃癌細(xì)胞在微重力環(huán)境中出現(xiàn)凋亡加重現(xiàn)象，這與本課題組前期對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究結(jié)果及其他學(xué)者對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞的研究結(jié)果一致，包括MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞、ML-1和ONCO-DG1甲狀腺癌細(xì)胞、DLD-1大腸癌細(xì)胞和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等[6,13,15-18]。林晶晶等[19]研究失重對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響，結(jié)果表明失重作為一種特殊因素可通過(guò)Caspase途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此微重力環(huán)境通過(guò)多種途徑能促使腫瘤細(xì)胞加劇凋亡，這對(duì)腫瘤細(xì)胞的失重應(yīng)激反應(yīng)具有重要意義。

本課題組還觀察到，HGC-27胃癌細(xì)胞經(jīng)RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)3 d后，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，空泡結(jié)構(gòu)增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞物質(zhì)的合成代謝至關(guān)重要，是一系列重要的生物大分子包括蛋白質(zhì)、脂類和糖類合成的重要場(chǎng)所。本課題組前期進(jìn)行模擬微重力對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞代謝組學(xué)影響的研究，發(fā)現(xiàn)RCCS模擬微重力顯著影響人HGC-27胃癌細(xì)胞脂類物質(zhì)的代謝，使磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、花生四烯酸和鞘氨酸在SMG組中顯著上調(diào)，而神經(jīng)鞘磷脂、磷脂酸、L-脯氨酸、肌酸、泛酸、氧化性谷胱甘肽、二磷酸腺苷和三磷腺苷顯著下調(diào)，這些物質(zhì)對(duì)人HGC-27胃癌細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生顯著的影響，進(jìn)而影響到細(xì)胞增殖、周期和遷移等功能[9]。進(jìn)一步印證了失重對(duì)HGC-27胃癌細(xì)胞的影響發(fā)生在超微結(jié)構(gòu)層面和代謝組學(xué)水平。

綜上所述，RCCS模擬微重力能夠顯著影響人HGC-27胃癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)周期、凋亡及超微結(jié)構(gòu)。失重對(duì)HGC-27胃癌細(xì)胞的研究結(jié)果，對(duì)豐富航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論、為航天員長(zhǎng)期駐留太空的醫(yī)學(xué)保障思路，以及探討失重特殊環(huán)境影響胃癌細(xì)胞病理機(jī)制等具有重要意義。