一株由鴨頭分離的巴氏桿菌鑒定與分析

李潤(rùn)楠

（山東省博興縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心 山東濱州 256500）

鴨巴氏桿菌?。带喕魜y或鴨出血性敗血癥）是目前養(yǎng)鴨業(yè)中一種常見(jiàn)的、危害嚴(yán)重的細(xì)菌類(lèi)疾病。該病是一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。其病原菌為禽多殺性巴氏桿菌，該菌可感染多種家禽（如雞、鴨、鵝等）和野鳥(niǎo)。鴨巴氏桿菌病具有發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn)，臨床上多表現(xiàn)腹瀉等癥狀，剖檢的主要特征為敗血癥病狀，通常表現(xiàn)肝臟顏色變淺，且其表面散布針尖大小灰白色的壞死點(diǎn)，十二指腸出血較為嚴(yán)重，心包積液等病理變化，通常發(fā)病率和死亡率均比較高。近年來(lái)隨著集約化、放牧式養(yǎng)鴨模式的快速發(fā)展，鴨巴氏桿菌病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，造成了嚴(yán)重的危害。鴨巴氏桿菌病在我國(guó)部分地區(qū)發(fā)病情況還是比較嚴(yán)重的，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此必須加強(qiáng)對(duì)該病的防控。本文總結(jié)了一例由鴨頭分離出的禽巴氏桿菌的鑒定，并進(jìn)行了簡(jiǎn)要的分析，以供參考。

1 發(fā)病情況

山東某養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)50～60 日齡的櫻桃谷肉雛鴨突然發(fā)病，大部分病鴨精神萎靡，羽毛松亂，尾翅下垂，腹瀉，排帶有少量血液的腥臭味稀糞，呈白色或黃綠色；嚴(yán)重病鴨兩腿酸軟，行動(dòng)緩慢，或癱瘓?jiān)诮锹?，不能走?dòng)；食欲廢絕，喝水欲增加，口鼻中有酸臭味的液體流出，呼吸困難，大口喘氣，頻繁搖頭，體溫升高，多在42～43℃。發(fā)病1d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，送診時(shí)已死亡100 羽左右。根據(jù)臨床表現(xiàn)初步診斷可能是禽巴氏桿菌病，但該養(yǎng)殖場(chǎng)前一段時(shí)間剛剛控制了一起鴨疫的疫情，因此不能排除鴨疫再次感染，需進(jìn)一步檢測(cè)。

2 病理變化

對(duì)送檢的病死鴨進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)呼吸道黏膜充血和出血性炎癥，皮下組織、腹膜均有出血點(diǎn)，腸道黏膜有充血或呈現(xiàn)卡他性的炎癥，尤以前半段小腸最為嚴(yán)重，腸內(nèi)容物呈污紅色。肝臟腫大，有出血點(diǎn)和灰白色壞死點(diǎn)，呈墨綠色，心臟冠狀溝脂肪、心肌及心內(nèi)膜充血或出血，心包內(nèi)有橙黃色滲出液，膽囊腫大。無(wú)菌采集病死鴨肝臟、鴨頭等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定。

3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在生物安全柜內(nèi)將病死鴨的肝臟、腦等組織分別接種于麥康凱平皿和含4%犢牛血清的TSA 平皿，37℃培養(yǎng)24h 后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)果麥康凱上均無(wú)菌落，在TSA 平皿上均出現(xiàn)圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的菌落，且菌落周?chē)蝗苎?；分別選取肝臟、鴨頭分離菌單菌落接種到含4%犢牛血清的TSA 平皿上進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察菌體的大小、形態(tài)及結(jié)構(gòu)。結(jié)果肝臟和鴨頭中分離菌均為革蘭氏陰性小桿菌，單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)，呈卵圓形。

4 PCR 鑒定

用禽多殺性巴氏桿菌和鴨疫李默氏桿菌特異性基因引物進(jìn)行PCR 鑒定。挑取單個(gè)疑似菌落于100μL 無(wú)菌的ddH2O 中，沸水中煮沸10min，10,000rpm 離心5min，取上清液作為PCR 模板。PCR 體系為：2× Taq PCR Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，補(bǔ)滅菌水至20μL，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照分別選用巴氏桿菌和鴨疫李默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠板電泳后，凝膠板在凝膠成像儀成像分析，結(jié)果反應(yīng)條帶的大小與巴氏桿菌預(yù)期大小相符，鴨疫李默氏桿菌引物PCR 無(wú)條帶。由此可以確定該養(yǎng)鴨場(chǎng)只是多殺性巴氏桿菌病，并從鴨頭中也分出了多殺性巴氏桿菌病原體。

5 莢膜抗原血清型鑒定

為進(jìn)一步確定分離株血清型，用多殺性巴氏桿菌分型引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 體系為：2× Taq PCR Master Mix 10μL、引物各0.5μL、模板1μL，補(bǔ)滅菌水至20μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上出現(xiàn)1,000bp 左右的條帶，與A 型擴(kuò)增目的片段大小一致，因此確定該分離株是莢膜血清A 型的多殺性巴氏桿菌。

6 藥敏試驗(yàn)

選擇頭孢曲松、新霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、氨芐西林、恩諾沙星、多西環(huán)素、丁胺卡那、氟苯尼考、慶大霉素、紅霉素、頭孢噻肟、克林霉素、阿莫西林和多粘菌素B 共17 種藥敏片進(jìn)行常規(guī)藥物耐藥性分析。將分離的多殺性巴氏桿菌均勻接種到兩個(gè)含4%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，再將各藥敏片均勻放到平板的合適位置，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h 后，觀察并測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，進(jìn)而對(duì)藥物敏感性進(jìn)行判定。結(jié)果顯示該分離菌對(duì)丁胺卡那、頭孢噻肟呈現(xiàn)中度敏感，對(duì)磺胺甲基異惡唑和多粘菌素B 低敏，其余藥物均耐藥。以上鑒定和藥敏結(jié)果已反饋給相關(guān)養(yǎng)殖場(chǎng)，該場(chǎng)通過(guò)敏感藥物治療5d 后，病情逐漸好轉(zhuǎn)，得到了有效控制。

7 討論

經(jīng)過(guò)對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)鴨發(fā)病情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)場(chǎng)內(nèi)鴨舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地等活動(dòng)空間狹窄，場(chǎng)內(nèi)設(shè)施相對(duì)簡(jiǎn)陋，飼養(yǎng)管理水平較差，不久前剛剛發(fā)生一起鴨傳染性漿膜炎病情。此次疫情為急性發(fā)病，短期內(nèi)死亡較多，多數(shù)病鴨精神萎靡、呆立、行走無(wú)力、食欲廢絕，體溫上升，口鼻中流出酸臭味液體，呼吸困難，有的不斷甩頭等癥狀。結(jié)合飼養(yǎng)條件、衛(wèi)生管理、發(fā)病情況、臨床癥狀及病理變化等綜合分析初步診斷為巴氏桿菌感染，但不排除聯(lián)合感染鴨傳染性漿膜炎。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離培養(yǎng)，并結(jié)合特異性的PCR 檢測(cè)，最終確定該養(yǎng)鴨場(chǎng)感染A 型多殺性巴氏桿菌病。按照多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的不同，被分為A、B、D、E 和F 型5 種血清型，且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)。對(duì)病原菌鑒定時(shí)，有必要明確分離菌的血清型，可為分子流行病學(xué)調(diào)查和疫苗候選菌株的選擇提供科學(xué)參考。當(dāng)前我國(guó)禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型以A 型為主。本次分離除肝臟組織分出了多殺性巴氏桿菌病原外，在鴨頭中也分出了多殺性巴氏桿菌病原。

鴨巴氏桿菌感染是當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)中最常見(jiàn)的一種傳染病，雛鴨高度易感，且5 周齡以下的雛鴨死亡率較高。該病病原為條件性致病菌，在惡劣的環(huán)境條件或出現(xiàn)并發(fā)病時(shí)，鴨群發(fā)病率升高，死亡率增大。近幾年，禽巴氏桿菌病一般呈地方性流行或者散發(fā)，常與其他疾病混合性感染。在實(shí)際養(yǎng)殖中禽巴氏桿菌疾病的防控，不能單純的依靠應(yīng)用抗生素藥物，還應(yīng)提高養(yǎng)殖場(chǎng)獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度的科學(xué)執(zhí)行力。同時(shí)要加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，搞好養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生、定期消毒，尤其要消滅老鼠、禁止貓狗等動(dòng)物與禽群的接觸，從源頭上切斷傳染源，是控制該病發(fā)生、擴(kuò)散蔓延的重要防治手段。本研究選擇了臨床上應(yīng)用的17 種抗生素對(duì)分離的鴨巴氏桿菌進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該鴨場(chǎng)的禽巴氏桿菌除對(duì)丁胺卡那、頭孢噻肟、磺胺甲基異惡唑和多粘菌素B 四種藥物呈現(xiàn)出不同程度的敏感外，對(duì)其他的13 種抗生素均表現(xiàn)耐藥性，尤其對(duì)臨床常用藥物磺胺甲基異惡唑等表現(xiàn)出了高度耐藥性，這說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)的藥物耐藥情況非常嚴(yán)重，這與其日常養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的濫用有很大關(guān)系。耐藥性的嚴(yán)重為臨床上治療鴨巴氏桿菌病及其他細(xì)菌性疾病帶來(lái)很大困難，因此在實(shí)際養(yǎng)殖工作中一定要合理用藥，減少抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

鴨巴氏桿菌病臨床上常呈現(xiàn)急性敗血癥過(guò)程，急性型發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90%，該病呈世界性分布，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一，給我國(guó)的禽類(lèi)養(yǎng)殖市場(chǎng)帶來(lái)了巨大的損失和隱患。目前合理開(kāi)展全價(jià)細(xì)菌滅活疫苗的免疫接種能夠有較好的保護(hù)效果。同時(shí)利用流行菌株制備自家滅活苗也可以起到很好的預(yù)防效果。