利用分子標(biāo)記輔助選育抗條紋葉枯病粳稻新品系

何沖霄 董曉鳴 姚立生 孫明法 梁國(guó)華

(1.鹽城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 鹽城 224002；2，鹽城生物工程高等學(xué)校，江蘇 鹽城 224002；3.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

水稻條紋葉枯病是當(dāng)前江蘇等地區(qū)水稻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，對(duì)糧食安全和農(nóng)民收入造成極大影響[1，2]。采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑等方法對(duì)水稻條紋葉枯病的控制效果有限，在重發(fā)地區(qū)，并不能阻止條紋葉枯病的持續(xù)流行，選育抗病品種才是從根本上控制水稻條紋葉枯病危害的主要途徑[3]，目前在生產(chǎn)上使用的抗病品種一般也表現(xiàn)較好抗性，但產(chǎn)量、米質(zhì)方面存在或多或少的缺陷。所以培育既抗水稻條紋葉枯病又優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種成為當(dāng)前防治水稻條紋葉枯病的首要任務(wù)。但是通過傳統(tǒng)的育種方法要想選育抗性好、米質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高等集多個(gè)育種目標(biāo)于一體的品種需要很長(zhǎng)的育種年限。水稻條紋葉枯病抗性是由Stv-bi控制的，且已在第11染色體上精確定位，其連鎖標(biāo)記在育種群體的親本之間具有多態(tài)性[4-7]。這使得抗水稻條紋葉枯病基因的分子標(biāo)記輔助育種成為可能，目前這方面的報(bào)道較少見。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供體親本：鹽稻8號(hào)，含抗水稻條紋葉枯病基因，米質(zhì)一般，產(chǎn)量潛力有限。

輪回親本：鹽稻9號(hào)，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、不抗水稻條紋葉病。

親本和各世代中間材料見表1。

表1 親本和各世代中間材料

1.2 抗性基因的分子檢測(cè)

DNA提?。涸诿缙诟鞔郎y(cè)單株檢測(cè)分別掛牌編號(hào)，每株剪取幼葉7～8左右，用小量法(見附錄1)提取單株DNA,待測(cè)品系的檢測(cè)是每小區(qū)隨機(jī)取10株檢測(cè)。

分子標(biāo)記檢測(cè)：本研究中應(yīng)用的是與Stv-bi緊密連鎖的STS標(biāo)記，其引物的設(shè)計(jì)及STS分析均在揚(yáng)州大學(xué)植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室由梁國(guó)華教授指導(dǎo)完成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、1.5U的Taq酶、4nmol dNTP、10pmol引物、20ng模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，50～60℃退火1min，72℃延伸1.5min，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物上樣于含EB(溴化乙錠)的3%瓊脂糖凝膠，以120V電泳2h，于紫外燈和BIORAD凝膠成像儀下觀察、讀數(shù)。

1.3 條紋葉枯病抗性鑒定

田間自然接種鑒定：選水稻條紋葉枯病重病區(qū)(鹽城建湖)做試驗(yàn)田，從播種到成熟作不治蟲處理，利用田間的帶毒灰飛虱進(jìn)行自然接種水稻條紋葉枯病毒，讓其自然發(fā)病。待病情發(fā)展穩(wěn)定之后，調(diào)查發(fā)病情況，本研究采用了兩個(gè)抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)：一是株系發(fā)病率，即發(fā)生病癥的株數(shù)與總株數(shù)之比；二是病級(jí)指數(shù)，參照Washio的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)得出數(shù)據(jù)[8-10]。

分子標(biāo)記檢測(cè)鑒定：根據(jù)各回交世代分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，決定下一代回交的母本單株，最后各品系的檢測(cè)結(jié)果與田間自然抗性結(jié)果對(duì)比，最終判斷各品系的抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的選育

用抗水稻條紋葉枯病品種鹽稻8號(hào)改良不抗病，但高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的鹽稻9號(hào)，自2005年夏的雜交配組開始，歷經(jīng)三年6代的雜交、回交及人工選擇和分子標(biāo)記輔助選擇，于2008年夏初步育成近似于鹽稻9號(hào)的抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系21個(gè)，世代為BC3F3。其中有5個(gè)品系田間對(duì)條紋葉枯病有較好抗性、產(chǎn)量及綜合農(nóng)藝性狀比較理想，分別編為GK1、GK2、GK3、GK5、GK6，如圖1。

2005年鹽城鹽稻8號(hào)×鹽稻9號(hào)鹽稻8號(hào)為供體親本,鹽稻9號(hào)親本,得雜交種112粒?！?005年三亞F1×鹽稻9號(hào)雜種F1成苗33株,其中有8株為雜種,選一分蘗強(qiáng)的真雜交種與鹽稻9號(hào)雜交得雜種53粒。↓2006年鹽城BC1F1×鹽稻9號(hào)雜種成苗23株,經(jīng)分子檢測(cè)有5株含Stv-bi基因,5株中選編號(hào)為06GC1019號(hào)單株與鹽稻9號(hào)雜交得雜交種87粒。↓2006年三亞BC2F1×鹽稻9號(hào)雜種成苗28株,經(jīng)分子檢測(cè)有7株含Stv-bi基因,7株中選編號(hào)為06HG012號(hào)單株與鹽稻9號(hào)雜交得雜交種34粒。↓2007年鹽城BC3F1成苗19株,經(jīng)分子檢測(cè)有7株含Stv-bi基因,7株全部自交得7個(gè)株系種。田間編號(hào)為07G01、07G02、07G05、07G06、07G08、07G09、07G10?！?007年三亞BC3F2上代當(dāng)選的7個(gè)株系每個(gè)株系種植400株,田間號(hào)分別為07HGF201、07HGF202、07HGF203、07HGF204、07HGF205、07HGF206、07HGF207。根據(jù)田間長(zhǎng)勢(shì)淘汰了受低溫危害結(jié)實(shí)率偏低的4個(gè)株系,在株系田間號(hào)為:07HGF201、07HGF202、07HGF204的3個(gè)保留株系中分別選單株7個(gè)共計(jì)21個(gè)單株?！?008年鹽城BC3F3當(dāng)選的21個(gè)單株分別種成21個(gè)小區(qū),每小區(qū)4m寬1.3m。栽插規(guī)格20cm×20cm。

圖1抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的選育過程

2.3 各品系的抗性鑒定

2.3.1大田自然接種鑒定。對(duì)同等條件下種植的21個(gè)品系進(jìn)行水稻條紋葉枯病田間抗性調(diào)查，結(jié)果表明21個(gè)品系分屬上代的3個(gè)株系，其中GK1-7是07HGF21的后代，其抗性表現(xiàn)最好，除GK7是中抗外(分離)，其它6個(gè)均抗。另兩個(gè)株系07HGF22和07HGF24的后代中僅有一個(gè)品系是抗，其余均為感，見表2。

表2 2008年正季親本和個(gè)品系大田自然接種后對(duì)RSV的抗性表現(xiàn)

注：“*”表示當(dāng)選品系，R為抗、MR為中抗、S為感病。

2.3.2分子標(biāo)記檢測(cè)抗性。21個(gè)品系對(duì)不同引物的檢測(cè)結(jié)果并不完全一致，根據(jù)21個(gè)品系對(duì)6個(gè)引物的檢測(cè)匯總?cè)绫?，并選了其中的兩個(gè)電泳圖以供參考如圖2、3。表2、3顯示，GK1-GK7的7個(gè)品系(上代為07HGF21)與6個(gè)引物檢測(cè)，取得幾乎一致的結(jié)果，GK1-GK6全抗，GK7為分離(A29除外)。GK8-GK14的7個(gè)品系(上代為07HGF22)略有不同，其中GK8、GK9、GK12三個(gè)品系對(duì)不同引物檢測(cè)結(jié)果稍有不同。GK15-GK217個(gè)品系(上代為07HGF24)的檢測(cè)結(jié)果僅有GK15、GK20取得相同的結(jié)果，其它5個(gè)品系檢測(cè)結(jié)果都不一致。6個(gè)引物中A38與A36對(duì)所有品系的檢測(cè)結(jié)果完全一致，并且這個(gè)結(jié)果與大田自然抗性鑒定的結(jié)果相似程度最高，僅GK8和GK19不同，見圖2、表2。引物ZHSTS11-43與大田發(fā)病情況差別最大有6個(gè)品系的田間抗性與之不符，見表2、3。引物A31、A40分別有三個(gè)與大田不符，A29數(shù)據(jù)缺失過多無參考價(jià)值。

表3 21個(gè)粳稻新品系STS檢測(cè)結(jié)果

注：“0、1、2、3”分別表示數(shù)據(jù)缺失、感病、分離、抗病

P1P2 K1K21圖2 P1為抗病對(duì)照鹽稻8號(hào),P2為感病對(duì)照鹽稻9號(hào),標(biāo)記為A36(STS標(biāo)記)

P1P2 K1K21圖3 P1為抗病對(duì)照鹽稻8號(hào),P2為感病對(duì)照鹽稻9號(hào),標(biāo)記為ZHSTS11-43(STS標(biāo)記)

2.4 當(dāng)選5個(gè)品系農(nóng)藝性狀與鹽稻9號(hào)的比較

從苗期開始性狀觀察。將當(dāng)選的21個(gè)品系與輪回親本(種植在同等肥力條件和相同栽培管理的試驗(yàn)田中)作比較，總的看來，21個(gè)品系的田間表現(xiàn)明顯可分成三個(gè)大類每類7個(gè)，它們分別屬于上代的三個(gè)不同群體(見表2)。在苗期至分蘗盛期各株系與親本的表現(xiàn)差別不明顯;分蘗盛期之后各品系逐漸表現(xiàn)出與親本的差異，GK1-7株高明顯高于親本，抽穗期遲于親本3d，GK8-14株高與親本相似，抽穗期與親本相近，GK15-21株高比親本偏矮，抽穗期早3d左右。三個(gè)大類中差別較小，僅在株高和生育期，及芒的有無等方面有所不同。各品系內(nèi)差別更小，但GK7品系內(nèi)性狀尚有分離。

5個(gè)抗病品系農(nóng)藝性狀與鹽稻9號(hào)室內(nèi)考種結(jié)果的比較結(jié)果列于表4。輪回親本鹽稻9號(hào)因發(fā)病影響了產(chǎn)量，但株高和分蘗性及生育期等性狀仍比當(dāng)選品系有優(yōu)勢(shì)。

表4 當(dāng)選的5個(gè)抗病品系農(nóng)藝性狀與鹽稻9號(hào)室內(nèi)考種結(jié)果的比較

3 討論

用分子標(biāo)記輔助選擇方法培育抗病品種是既高效又經(jīng)濟(jì)的手段，它不受環(huán)境條件的影響，借助緊密連鎖的分子標(biāo)記可以在植物生長(zhǎng)的任何階段對(duì)抗性基因進(jìn)行鑒定和選擇，而分析手段快速簡(jiǎn)便，提高了選擇的效率，加快了育種進(jìn)程。研究所用的分子標(biāo)記準(zhǔn)確可靠、操作方便，有很高的使用價(jià)值。個(gè)別數(shù)據(jù)與大田發(fā)病有出入可能是群體基因尚未純合一致導(dǎo)致的取樣誤差。

本研究用分子標(biāo)記輔助選擇方法初步選育出了與親本相似，而抗性明顯優(yōu)于輪回親本的5個(gè)粳稻品系，說明利用分子標(biāo)記輔助選育抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的方法是可行的。但是當(dāng)選的5個(gè)品系雖然經(jīng)歷了三年六代的單株系選，基本達(dá)到了集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病于一體的目標(biāo)。但各品系間、品系內(nèi)尚有分離，差別較大的親本存在多對(duì)基因的差異，為我們進(jìn)一步篩選抗病的純合品系，提供了豐富的基礎(chǔ)材料。

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