鋅對鎘脅迫下黃菖蒲抗氧化酶系統(tǒng)及富集鎘的影響

馬歡歡 ，高 峰 ，樊向陽 ，胡 超 ， 崔二蘋 ，劉春成 ，莫 宇 ，張 茜

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)田灌溉研究所，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院， 北京100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)水資源高效安全利用重點開放實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453002）

0 引 言

【研究意義】鎘（Cd）污染在世界大多數(shù)國家普遍存在，是非常棘手的環(huán)境問題之一。不合理的工業(yè)采礦以及化學(xué)品的濫用導(dǎo)致了土壤和水生態(tài)系統(tǒng)被重金屬不同程度地污染[1]。一些耕地資源充足的發(fā)達國家，針對不同程度的Cd 污染耕地，可以采取優(yōu)勝劣汰政策，將質(zhì)量好的耕地用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動，將Cd 污染農(nóng)田用于種植林木或其他非農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動[2]。根據(jù)2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》，我國的土壤環(huán)境狀況不容樂觀，耕地土壤存在較大的污染問題。重金屬Cd 的點位超標率達到7%[3]，且我國人均耕地面積只占世界平均水平的1/3，為了糧食安全，必須采取一定措施來治理土壤Cd 污染問題。【研究進展】Pedro 等[4]研究表明，當Cd 在植物體內(nèi)積累到一定水平時，會對植物產(chǎn)生一定的毒性，植物會表現(xiàn)出枯葉、側(cè)根數(shù)減少的癥狀，在一定條件下甚至?xí)?dǎo)致死亡。Cd 對大多數(shù)植物和生物都是有毒的，植物根系從土壤和水中吸收Cd，進而進入食物鏈[5]，對人類健康構(gòu)成威脅[6]。Zhao 等[7]研究了不同途徑對稻田系統(tǒng)Cd 的輸入，發(fā)現(xiàn)灌溉水Cd 輸入量達到每年1～400 g/hm2。Hou 等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，灌溉水是長江三角洲農(nóng)田Cd 主要來源。灌溉水Cd 由于其賦存形態(tài)生物活性高，遷移轉(zhuǎn)化迅速，而且水稻的灌溉定額很高，輸入稻田Cd 通量較大，灌溉水帶來的Cd 需引起重視[9]。對于水源中Cd 的凈化技術(shù)國內(nèi)外已開展了大量研究。人們開發(fā)了各種方法來修復(fù)Cd 污染的土壤和水[10]。1980 年以來，人工濕地由于其環(huán)保功能，同時具有較高的生態(tài)價值，成為一種備受關(guān)注的污水處理工藝。植物是人工濕地的重要組成部分。濕地植物已被證明是一種從生物學(xué)上去除水中Cd 的經(jīng)濟技術(shù)，并受到越來越多的關(guān)注[11]。有研究表明，西伯利亞鳶尾具有較強的吸收和富集重金屬的能力，且主要在根部[12]。張玲等[13]研究人工濕地基質(zhì)以及濕地植物對重金屬Cd、Pb 的富集特性，結(jié)果顯示，燈芯草對復(fù)合重金屬Cd、Pb 有較好的富集特性，并且燈芯草的根、莖、葉對重金屬Cd、Pb 的富集能力也各有不同，其中燈芯草根部對重金屬Cd、Pb 的富集效果明顯大于莖、葉。濕地植物必須選擇高度積累并能承受各種有毒脅迫的植物才能取得好的效果[14]。研究發(fā)現(xiàn)，當菖蒲中Cd 質(zhì)量濃度達到1 000 mg/L 時，菖蒲能夠健康地生長[15]。Ma 等[16]研究發(fā)現(xiàn)當Cd 的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，會促進黃菖蒲的生長。因此，本研究采用黃菖蒲作為受試植物。Cd 脅迫對植物造成的氧化脅迫是鎘毒害機理之一，許多研究顯示Cd 導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧自由基積累，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞和生物膜系統(tǒng)損傷，對植物造成嚴重傷害[17]。Zn 和Cd屬于同一族元素，具有相同的核外核結(jié)構(gòu)和相似的化學(xué)性質(zhì)，在水稻細胞中具有相同的轉(zhuǎn)運通道[18]。目前關(guān)于Zn 對作物吸收Cd 影響的結(jié)論并不一致。有研究表明Zn 主要起協(xié)同作用[19-21]，也有研究表明起拮抗作用[22-24]。She 等[25]發(fā)現(xiàn)添加Zn 可以抑制苧麻中Cd 的積累，而Wang 等[26]發(fā)現(xiàn)在水稻土中添加Zn 可以提高水稻籽粒中含Cd 量。土壤中Zn 可以增加大白菜可食用部分的含Cd 量[23]。水稻中Cd 的質(zhì)量分數(shù)與土壤中Zn 的質(zhì)量分數(shù)顯著正相關(guān)，表明Zn 的存在會促進作物對Cd 的吸收抗性[26]。這些相互矛盾的結(jié)果表明，Zn 對Cd 植物吸附的影響是復(fù)雜的，還需要進一步深入研究[27]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過水培試驗研究Cd 脅迫對黃菖蒲抗氧化系統(tǒng)的影響，以及Cd 在黃菖蒲植株中的積累特性，探討黃菖蒲對重金屬污染水體的修復(fù)機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)田灌溉研究所洪門野外科學(xué)觀測站的人工氣候室進行。將飽滿的黃菖蒲種子在2% NaClO 溶液中消毒30 min，然后在去離子水中浸泡24 h，最后在育苗基質(zhì)中培育。育苗基質(zhì)由1∶1∶1 的泥炭、珍珠巖、園藝蛭石組成。14 d后，選取大小均勻、生長一致的幼苗移入8 L 的水培箱中（長41 cm×寬24 cm×高14 cm）中，在霍格蘭氏營養(yǎng)液中生長使其逐漸適應(yīng)營養(yǎng)液環(huán)境。待黃菖蒲幼苗適應(yīng)營養(yǎng)液的生長環(huán)境后，選取大小均勻、生長一致的幼苗將其分別移栽到2 L 充滿全營養(yǎng)液的聚乙烯小桶中，備用于試驗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置了12 個處理。Cd 采用CdCl2·2.5H2O（優(yōu)級純）。Cd2+的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0、0.5、5 mg/L，分別記為Cd0、Cd0.5、Cd5。Zn 采用ZnSO4·7H2O（優(yōu)級純）。Zn2+的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0、50、100、150 mg/L，分別記為Zn0、Zn50、Zn100、Zn150。Hoagland營養(yǎng)液配方：4.002 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O，5.005 mmol/L KNO3，2 mmol/L MgSO4，1 mmol/L KH2PO4，22.4 mmol/L FeEDTA，1 mmol/L NH4NO3，0.2 μmol/L CuSO4，1.2 μmol/L Na2MoO4，5 μmol/L KI，100 μmol/L H3BO3，66 μmol/L MnSO4，2 μmol/L ZnSO4，2 μmol/L CoCl2組成。溶液pH 值用HCl 或NaOH 調(diào)整為5.5。每個聚乙烯小桶中種植3 株植物，所有處理均設(shè)置3 次重復(fù)。聚乙烯小桶完全隨機放置在人工氣候室中，設(shè)置為12 h、30 ℃日光周期，12 h、20 ℃黑暗周期，光照強度設(shè)置為1 000 μmol2/s 來模擬植物生長的真實環(huán)境。培養(yǎng)液每3 天更換1 次。

1.3 測試指標與方法

經(jīng)過45 d 的處理，收獲植物，立即用去離子水沖洗干凈，并將植物根和葉分離。將植物樣本一部分在105 ℃的烘箱中殺青20 min，然后在60 ℃的溫度下干燥2 d 直至達到恒質(zhì)量，用于重金屬Cd 的測定。第2 部分用液氮迅速冷凍，并儲存于-80 ℃的冰箱中，用于植物超氧化歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的測定。

1.3.1 SOD、POD、CAT 以及MDA 的測定

SOD、POD、CAT 以及MDA 分別采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的超氧化物歧化酶測試盒、過氧化物酶測試盒、過氧化氫酶測試盒和丙二醛測試盒測定。

1.3.2 黃菖蒲植物組織中Cd 的測定

烘干后的根、葉用研磨機磨碎后過100 目篩，然后在聚氟四乙烯（PTFE）消煮管中稱取約0.20 g 植物樣，加入10 mL HNO3（優(yōu)級純），用微波消解儀（MarsCEM 240/50）進行消解，在120 ℃下消解3 min，160 ℃消解3 min，180 ℃消解25 min，同時做4 個空白。消解結(jié)束后，用5 mL 1%的HNO3清洗消煮管3 次，并轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，用去離子水定容至50 mL，待測。采用原子吸收分光光度法（AA-6300FG，島津）測定溶液中的Cd。

1.4 數(shù)據(jù)處理

富集系數(shù)（BCF）表征黃菖蒲積累重金屬Cd 的能力；轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF）表征重金屬通過根部進入地上部的能力，計算式為：

式中：BCF 為黃菖蒲對重金屬Cd 的富集系數(shù)；S 為黃菖蒲地上部或地下部重金屬量（mg/kg）；T 為溶液中相應(yīng)重金屬量（mg/L）。富集系數(shù)越大，表示黃菖蒲積累重金屬能力越強[28]。

式中：TF 為重金屬Cd 轉(zhuǎn)運系數(shù)；S 為黃菖蒲地上部位重金屬含Cd 量；R 為根部含Cd 量。TF 越大，表明重金屬從根系向地上部器官轉(zhuǎn)運能力越強[29]。

所有數(shù)據(jù)均采用DPS 和Excel 2010 進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn對Cd脅迫下黃菖蒲超氧化物歧化酶活性的影響

加Zn 處理下，Cd 對黃菖蒲根和葉中SOD 活性影響如圖1 所示（圖中不同小寫字母代表在p<0.05水平有顯著性差異）。添加Zn 后，黃菖蒲根中SOD活性顯著提高，其中Zn100 處理組中SOD 活性達到最大值，Zn50 處理下，在Cd0.5 和Cd5 處理中SOD活性略微下降，但不顯著。不添加Cd 的空白對照組中，不同質(zhì)量濃度Zn 處理下的黃菖蒲根SOD 活性均高于對照組。然而，由圖1（b）可見，黃菖蒲葉中SOD 活性與根中SOD 活性的變化趨勢有較大差別。在Cd0.5 和Cd5 處理組中，Zn 的添加顯著降低了葉中SOD 活性。不添加Cd 的空白對照組中，除Zn50處理組略低于Zn0 處理外，其他質(zhì)量濃度Zn 處理下的黃菖蒲根SOD 活性均顯著高于對照組，與根中對照組SOD 酶的變化趨勢相同?？梢姡诓煌|(zhì)量濃度Cd 和Zn 處理下，黃菖蒲根和葉中SOD 緩解重金屬脅迫的作用機制不同，受其所處的根和葉的內(nèi)部環(huán)境影響。

圖1 Cd 脅迫下添加Zn 黃菖蒲SOD 活性 Fig.1 Zn on SOD activity of Iris pseudacorus under stress of Cd

2.2 Zn 對Cd 脅迫下黃菖蒲過氧化物酶活性的影響

加Zn 處理下，Cd 對黃菖蒲根和葉中POD 活性影響如圖2 所示。由圖2（a）可見，在不添加Cd 處理組中，除Cd0 Zn150 處理組外，添加Zn 處理后，黃菖蒲根中POD 活性顯著提高。不同質(zhì)量濃度Cd處理下，均在Zn100 達到最大值。不添加Cd 的對照組中，Zn150 處理下，POD 活性明顯降低，可見單獨添加高質(zhì)量濃度的Zn 對黃菖蒲根POD 活性造成損傷。

圖2 Cd 脅迫下添加Zn 黃菖蒲POD 活性 Fig.2 Zn on POD enzyme activity of Iris pseudacorus under the stress of Cd

由圖2（b）可見，對照組中，單獨添加高質(zhì)量濃度Zn（Zn150），葉POD 活性反而達到最大值，單獨添加Zn 后，黃菖蒲根和葉中POD 活性變化趨勢相反。Cd0.5 和Cd5 處理下，葉POD 變化趨勢相同，均是先升高，后降低，再升高，在Zn100 處理達到最小值。對于葉中POD 活性，沒有加Zn 處理組中POD活性隨著Cd 質(zhì)量濃度的增加顯著下降，說明隨著Cd質(zhì)量濃度的提高，POD 活性受到破壞。Zn50 處理組中，POD 活性隨著Cd 質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，對于Zn100 和Zn150 處理組，POD 活性隨Cd 質(zhì)量濃度的增加先降低后升高。

2.3 Zn 對Cd 脅迫下黃菖蒲過氧化氫酶活性的影響

加Zn 處理下，Cd 對黃菖蒲根和葉中CAT 活性影響如圖3 所示。由圖3（a）可見，對于黃菖蒲根中CAT 活性，在Zn0 處理組中，CAT 活性隨Cd 質(zhì)量濃度的增大而增大，Zn50 和Zn150 處理組中，CAT 活性隨Cd 質(zhì)量濃度的增加先降低后升高，在Cd0.5 處理組達到最低水平。Zn100 處理組中CAT 活性隨Cd濃度的增加而減小。不添加Cd 的對照組中，CAT 活性均高于Zn0，且隨著Zn 質(zhì)量濃度的升高而降低。

由圖3（b）可見，對于葉中CAT 活性，只有Cd0.5 Zn50 處理組的CAT 活性顯著高于對照組，Cd0 Zn100和Cd0 Zn150 處理組中CAT 活性與對照組相當，其他均顯著低于對照組。黃菖蒲根和葉中CAT 活性均在Cd0.5 Zn150 處理達到最小值。

圖3 Cd 脅迫下添加Zn 黃菖蒲中CAT 活性 Fig.3 Zn on CAT enzyme activity in Iris pseudacorus under the stress of Cd

2.4 Zn 對Cd 脅迫下黃菖蒲丙二醛量的影響

加Zn 處理下，Cd 對黃菖蒲根和葉中MDA 量的影響如圖4 所示。由圖4（a）可見，加Zn 處理后，除葉Cd0 Zn150、Cd0.5 Zn50 處理組外，黃菖蒲根和葉中MDA 量均顯著低于不加Zn 的對照組。對于黃菖蒲根中MDA 量，添加不同質(zhì)量濃度的Zn 顯著降低了MDA 量，但添加不同質(zhì)量濃度Zn 處理之間沒有顯著差異。

由圖4（b）可見，對于黃菖蒲葉中MDA 量，除Cd0 Zn150、Cd0.5 Zn50 處理組外，不同質(zhì)量濃度Cd脅迫下，Zn 的添加顯著降低了MDA 量，且不同濃度Zn 處理之間達到顯著水平。不添加Cd 的空白對照組中，MDA 量隨Zn 質(zhì)量濃度的增加而增加，Cd0.5 處理組中，MDA 量隨Zn 質(zhì)量濃度的增加而降低。

圖4 Cd 脅迫下添加Zn 黃菖蒲根和葉中MDA 量Fig.4 Zn on MDA content in Iris pseudacorus under the stress of Cd

2.5 Zn 對黃菖蒲富集Cd 的影響

加Zn 處理下，黃菖蒲對Cd 的轉(zhuǎn)運和富集系數(shù)如表1 所示。不同質(zhì)量濃度Zn 處理下，除個別處理外，顯著提高了黃菖蒲對Cd 的富集系數(shù)。相同條件下，黃菖蒲地上部分對Cd 的富集系數(shù)均大于地下部分對Cd 的富集系數(shù)。黃菖蒲對Cd 的轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1。在Cd0.5 處理組中，Zn100 處理下，黃菖蒲的轉(zhuǎn)運系數(shù)達到最大值，在Cd5 處理組中，Zn150 處理下，黃菖蒲的轉(zhuǎn)運系數(shù)達到最大值，Cd0.5 和Cd5 處理組中，不同質(zhì)量濃度Zn 的添加提高了黃菖蒲地上和地下部分的富集系數(shù)，且地上部分和地下部分富集系數(shù)在Zn50 處理組達到最大。

表1 黃菖蒲對重金屬Cd 的轉(zhuǎn)運和富集系數(shù) Table 1 Translocation factors and enrichment coefficients

3 討 論

重金屬脅迫對植物的生長發(fā)育表現(xiàn)出一定的抑制作用，重金屬超過一定質(zhì)量濃度，植物體會表現(xiàn)出生長矮小，生長停滯等現(xiàn)象[30]。植物體在Cd 脅迫的環(huán)境下，其體內(nèi)活性氧自由基，如H2O2、O2-量顯著增加，同時造成MDA 量的升高，說明植物體內(nèi)發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化，這是造成植物氧化損傷的主要原因之一[31]。MDA 是植物體內(nèi)發(fā)生細胞膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，是細胞損傷程度的標志性物質(zhì)，其量高低表明了植株遭受逆境脅迫的強弱[32-33]。在Cd 脅迫下，不同植物體內(nèi)MDA 的變化不同。抗氧化酶是植物抗氧化系統(tǒng)中重要的組成部分。本研究中，添加Zn 處理后，黃菖蒲根和葉中MDA 量顯著降低，說明Zn的添加緩解了Cd 對黃菖蒲的脅迫。

為適應(yīng)逆境脅迫，降低對植株的毒害，植株體內(nèi)會激活SOD、POD、CAT 等抗氧化酶系統(tǒng)，來清除活性氧自由基對植株的毒害，進行自我保護，防止其對細胞造成損傷[34]。SOD、POD、CAT 等抗氧化酶是植物體內(nèi)有效的活性有氧自由基清除系統(tǒng)，SOD通過把植物體內(nèi)多余的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫來緩解逆境的脅迫[35]。本研究中，添加Zn 處理后，黃菖蒲根中SOD 活性顯著提高，而葉中SOD 活性顯著降低，可能是因為根是植物直接接觸脅迫環(huán)境的部分，根部SOD 活性首先被激活來分解植物根部由于脅迫而產(chǎn)生的活性自由基。而葉SOD 活性則可能是等到Cd 由根部輸送到葉片，并累積到一定閾值之后才逐漸被激活。而POD 和CAT 則可以將過氧化氫分解為無毒無害的水[36]。Zn 和Cd 屬于同族化學(xué)元素，具有相似的化學(xué)性質(zhì)、相同的價態(tài)和相似的離子半徑[37]，可以通過相同的轉(zhuǎn)運子ZIP 和HMA4 進入植物體內(nèi)[38]。當Zn 質(zhì)量濃度從0～50 mg/L 時，推測Zn 與Cd 對根系吸附位點的競爭促進植物對Cd 的吸收和Cd 在根系中的積累，并在植株體內(nèi)形成逆境脅迫。大量研究表明，逆境脅迫初期，植株體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧導(dǎo)致抗氧化酶活性的增加，隨著逆境脅迫持續(xù)進行，超過植物自身耐受程度，從而導(dǎo)致抗氧化酶活性下降[39]。本研究中，添加Zn 處理后，黃菖蒲根POD 活性顯著提高，而黃菖蒲葉中POD 活性在高質(zhì)量濃度Zn（Zn150）處理后顯著提高，在高質(zhì)量濃度Zn 處理下，使植物葉片所受脅迫增加，導(dǎo)致POD活性增強。對于CAT 活性，對照組不添加Zn 處理，CAT 活性隨Cd 質(zhì)量濃度的增加而增加，說明此時CAT 活性還沒有受到Cd 的破壞，添加Zn 處理后，在不添加Cd 的處理組，根CAT 活性顯著提高，在不同質(zhì)量濃度Cd 處理下（Cd0.5，Cd5），根CAT 活性顯著降低，說明Cd 和Zn 的共同作用導(dǎo)致CAT 活性降低。當Zn 質(zhì)量濃度增加到100 mg/L 時，POD 活性保持較高水平，SOD 活性升高，而CAT 活性降低，可能是由于Zn 和Cd 的拮抗作用導(dǎo)致植物對Cd 的吸收減少，使植物體內(nèi)重金屬脅迫降低。Zn 質(zhì)量濃度進一步增加至150 mg/L 時，推測是因為植株根系細胞膜通透性增加[40]，并導(dǎo)致植物根系對Cd 和Zn 的吸收。相關(guān)的CAT 活性的增加并不能彌補POD 和SOD 活性的損失，從而阻止植物的生長。葉片中CAT活性均顯著低于對照組，可能是因為Cd 和Zn 的拮抗作用，導(dǎo)致葉片中的Cd 的累積不足以激活葉片中的CAT 活性。不同質(zhì)量濃度Cd 脅迫下，添加Zn 后，黃菖蒲的地上和地下部分對Cd 的富集系數(shù)均顯著提高，Cd0.5 處理組中，Zn50 和Zn150 處理組下，黃菖蒲地上和地下部分的富集系數(shù)明顯高于其他處理；Cd5 處理組中，Zn50 處理下，黃菖蒲的地上和地下部分對Cd 的富集系數(shù)達到最大，可見Zn 對黃菖蒲富集重金屬Cd 起到一定作用。推測是因為Zn 和Cd在理化性質(zhì)方面有不同程度的相似性別，Zn 在營養(yǎng)液中的絕對量及與Cd 離子的比例必然對Cd 在土壤中的活性及植物對Cd 的吸收、運轉(zhuǎn)等產(chǎn)生一定影響，而且過量的Zn 可能會下調(diào)與Zn 轉(zhuǎn)運子相關(guān)的基因，而Zn 轉(zhuǎn)運子也負責植物對Cd 的吸收[41]。0.5 mg/L 質(zhì)量濃度Cd 處理下，添加50、150 mg/L 質(zhì)量濃度Zn，黃菖蒲地上和地下部分對Cd 的富集系數(shù)分別增加了46.48%、58.71%、43.85%、42.05%，5 mg/L 質(zhì)量濃度Cd 處理下，添加50、150 mg/L 質(zhì)量濃度Zn，黃菖蒲地上和地下部分對Cd 的富集系數(shù)分別增加了16.13%、9.77%、23.93%、1.89%。對于Cd0.5 脅迫下，Zn100 處理組的黃菖蒲轉(zhuǎn)運系數(shù)達到最大，且顯著高于對照組，Cd5 脅迫下，Zn150 處理組的黃菖蒲轉(zhuǎn)運系數(shù)達到最大值。綜合考慮，Zn50 處理更有利于黃菖蒲對Cd 的轉(zhuǎn)運和富集。

4 結(jié) 論

1）Zn 的添加緩解了Cd 對黃菖蒲植株的脅迫。對于黃菖蒲來說，Cd 脅迫下，植物根部SOD 較葉片先被激活。

2）Zn 的添加使黃菖蒲根中POD 活性提高，但是低質(zhì)量濃度Zn（50 mg/L 和100 mg/L）使黃菖蒲葉片中POD 活性降低。不添加Cd 的情況下，Zn 的添加使黃菖蒲根CAT 活性顯著提高。

3）黃菖蒲對Cd 的轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1。不同質(zhì)量濃度Zn 的添加提高了黃菖蒲地上和地下部分對Cd的富集系數(shù)。綜合考慮，在0.5 和5 mg/L Cd 污染下，添加50 mg/L 質(zhì)量濃度Zn 更有利于黃菖蒲對Cd 的轉(zhuǎn)運和富集。