γ-聚谷氨酸的合成及應用研究

張雋嫻

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(武漢)，湖北 武漢 430064)

1 引言

γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamic acid)，γ-PGA]是一種由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基縮合脫去水分子后，以γ-酰胺鍵結(jié)合形成的聚氨基酸化合物[1]。不同的微生物合成的γ-PGA的相對分子量和分子立體結(jié)構(gòu)各異，相對分子量一般在10萬～200萬之間。1937年，Ivanovic最早發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌可以產(chǎn)生聚谷氨酸，隨后不斷有學者發(fā)現(xiàn)枯草研報桿菌等其他芽孢桿菌都可以產(chǎn)生γ-PGA[2]。γ-PGA是一種高分子陰離子聚合物，具有可食用性和生物可降解性，對人體和環(huán)境無害，廣泛應用于生產(chǎn)生活各個領(lǐng)域。

2 理化性質(zhì)

通過酸堿滴定法測得γ-PGA的pKa值為2.23，這與谷氨酸α-羧基的pKa值相當。γ-PGA鈉鹽的旋光度為-70，平均分子量為1.23×105kDa。通過熱性質(zhì)分析實驗，測得其熱分解溫度為235.9 ℃，熔點為223.5 ℃。通過高效液相色譜法可以測得其中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值穩(wěn)定在60∶40[3]。

分子量是高聚物的最主要參數(shù)之一，可以決定其性質(zhì)。一般來講，分子量越大持水性越強，但流變性越難控制，一定程度上增加了生產(chǎn)和應用的成本。目前可以通過多種方法來控制γ-PGA的分子量，一種是通過酸堿、超聲波、酶或微生物等對已合成的γ-PGA進行不同程度的降解，另一種是通過調(diào)節(jié)合成過程中的條件，例如改變碳氮比、無機鹽濃度等從而改變代謝產(chǎn)物的分子量[4]。

氨基酸同時具有羧基和羥基，屬于兩性物質(zhì)，γ-聚谷氨酸由于其大量游離羧基而具有良好的親水性和反應活性。γ-PGA溶于水后會形成具一定彈性的凝膠，凝膠彈性會隨溫度、pH值和無機鹽等因素的影響[5]。

3 應用分析

γ-PGA是一種高聚物，不同的分子量導致高聚物性質(zhì)各異，商業(yè)用途也不同[6]。因此，鑒于其優(yōu)良多變的理化和生物學性質(zhì)，γ-PGA的用途十分廣泛，極具研發(fā)和應用潛能。

3.1 在醫(yī)學中的應用

鑒于良好的親水性，γ-PGA可作為藥物載體，提高緩釋性和靶向性。另外，γ-PGA本身可降解，對身體無害，還可以降低藥物的毒副作用，增強藥物的穩(wěn)定性。如化療藥物會對病人健康細胞和癌細胞無差別破壞，如果將γ-PGA用于藥物載體，可以提高載藥量和穩(wěn)定性，降低對人體的損傷[3]。γ-PGA還可以作為載體，用于疫苗的開發(fā)[7]。

γ-PG還不失為一種優(yōu)良的生物醫(yī)學材料，可以作用黏合劑，防止手術(shù)過程中機體滲血[8]。

3.2 在食品中的應用

γ-PGA由谷氨酸聚合而成，可降解，因而能夠作為食品添加劑，例如增稠劑、防凍劑等，用于改善食品的品質(zhì)和色香味，以及保鮮防腐。

γ-PGA是一種優(yōu)良的抗凍劑，性質(zhì)優(yōu)于常用抗凍劑葡萄糖。而且相比于葡萄糖、無機鹽等常用的小分子防凍劑，γ-PGA味道更淡，因此對食味品質(zhì)影響更小[4]。

有研究表明，γ-PGA可以促進細胞內(nèi)鈣離子的吸收，因此可以作為營養(yǎng)助劑[9]。γ-PGA作為祛澀劑和祛苦劑，可以減少單寧、咖啡因等引起的苦味，提升商品的價值。

3.3 在日化用品中的應用

γ-PGA是一種高聚物，鑒于其超強的吸水性和緩釋能力，可以用于化妝品保濕。γ-PGA的保濕效果優(yōu)于透明質(zhì)酸，堪稱化妝品原料家族中的新“明星”，在日本護膚品品牌中比較常見。

此外，γ-PGA還可以廣泛用于制作濕巾、嬰兒尿不濕等衛(wèi)生用品[10]，既保濕又無害。

3.4 在農(nóng)業(yè)中的應用

γ-PGA優(yōu)良的吸水性和可降解性，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域同樣發(fā)揮出巨大的作用。日本學者以納豆中的γ-PGA為原料合成一種納豆樹脂，可以包裹在綠植種子的表面[10]。鑒于其環(huán)境友好性能，綠化效果良好的同時也避免了環(huán)境污染。

γ-PGA的強持水性使其具有控釋和緩釋作用，可以作為農(nóng)業(yè)投入品的緩釋劑，從而減少投入品的使用。此外，在土壤中加入一定量的γ-PGA，也可以提升土壤的保水性和透氣性，減少晝夜溫差，利于植物生長。

3.5 在其他領(lǐng)域的應用

γ-PGA可以扮演不同環(huán)境下對生物的保護劑，例如用于高滲透壓下對微生物的保護。還可以螯合金屬離子，應用于重金屬污染治理。

γ-PGA的羧基經(jīng)酯化處理后具有很好的熱塑性能，同時可以在自然界迅速降解，是環(huán)境友好型塑料的極佳選擇，具有非常廣闊的市場前景。日本味之素公司已成功開發(fā)和量產(chǎn)聚合氨基酸系列產(chǎn)品用于食品包裝[11]。

目前，水溶性高分子的生產(chǎn)和消費市場主要在美國、日本等發(fā)達國家。隨著中國的崛起，中國市場中水溶性高分子開始嶄露頭角，發(fā)展形勢良好，相信未來可以在國際市場擁有一定話語權(quán)。

4 制備方法

4.1 提取法

γ-PGA最初的生產(chǎn)采用提取法，源自日本納豆產(chǎn)業(yè)。納豆黏液中含有γ-PGA，用乙醇將納豆中的γ-PGA粗提取，然后進一步純化。但是納豆黏液中γ-PGA的分離純化存在一定難度，主要原因是存在其它黏性物質(zhì)的干擾，此外γ-PGA產(chǎn)量本身不高，這就拔高了生產(chǎn)成本，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

4.2 化學法合成

肽合成法是最原始的化學合成方法，是指通過條件催化，將谷氨酸單體一個一個連接成肽鏈，不會發(fā)生成環(huán)聚合[8]。傳統(tǒng)方法反應條件苛刻，步驟繁多，且產(chǎn)率不高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，更多地用于γ-PGA科學研究。

二聚體縮聚法是另外一種化學合成法，是指先由兩種不同構(gòu)型的谷氨酸單體反應生成α-甲基谷氨酸，然后再形成二聚體；無數(shù)的二聚體在一定的反應條件下形成高聚物，最后去甲基化得到γ-PGA。

化學合成法生產(chǎn)的γ-PGA分子量通常比較小，如果提高分子量則將面臨生產(chǎn)成本大幅提高的問題，所以化學合成法難以得到規(guī)?；瘧?。但對于探究γ-PGA的結(jié)構(gòu)如何影響其性質(zhì)和功能，以及γ-PGA的修飾技術(shù)具有研究價值。

4.3 酶法合成

酶法合成即利用生物酶代替化學催化劑，使谷氨酸單體聚合形成γ-PGA。由于生物酶的高效性和專一性，酶法合成γ-PGA的產(chǎn)量高，純度高，且生產(chǎn)效率高。

工藝簡單、速度快，易實現(xiàn)規(guī)?；敲阜ㄉa(chǎn)的優(yōu)點，但酶法合成具有和化學合成法同樣的缺點，即聚合物分子量不大；此外，生物酶的生產(chǎn)成本普遍較高，而γ-PGA合成反應所需的谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶本身在自然界的活性偏低，因此很大程度上制約了該方法的應用。

4.4 微生物發(fā)酵

相對而言，前3種方法大都存在產(chǎn)物分子量小、生產(chǎn)工藝復雜或成本高等劣勢，難以大量應用。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA具有不可比擬的優(yōu)勢，包括條件溫和、速度快、產(chǎn)率高、成本低、無污染等，廣受國內(nèi)外研究者青睞，逐步成為γ-PGA科研和生產(chǎn)的首要選擇。

日本對于微生物生產(chǎn)γ-PGA的研究一直處于世界領(lǐng)先水平，起源于納豆菌。近年來，我國高校和研究所也有不少致力于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA的科研團隊[12]?，F(xiàn)階段，微生物法生產(chǎn)的探索主要集中于如何利用基因工程手段選育優(yōu)良菌種。

4.4.1 合成機理

γ-PGA的合成機理至今仍在不斷研究中。由于產(chǎn)物中自然存在兩種構(gòu)型的谷氨酸單體，D-谷氨酸的來源成為了研究的核心問題。一般細菌細胞都具有丙氨酸消旋酶，細胞質(zhì)中瞬間會有D-丙氨酸存在。同理，研究者推測D-谷氨酸也可能由谷氨酸消旋酶作用產(chǎn)生。但因此途徑還需要研究探討。

γ-PGA和谷氨酸單體的供給關(guān)系也不清楚，不同的菌株表現(xiàn)各異，甚至相反。谷氨酸依賴性菌株B.subtilis IFO3335是目前研究最深入的生產(chǎn)菌之一，有關(guān)研究指出外源性谷氨酸單體并非合成γ-PGA的直接前體，而是發(fā)揮著生長調(diào)節(jié)劑的作用。內(nèi)源性谷氨酸則由甜酮戊二酸通過兩種不同的途徑合成。相反Ogawa等人通過14C追蹤法研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物γ-PGA中存在14C，也就是說培養(yǎng)基里的谷氨酸會被轉(zhuǎn)化到多聚物中[13]。總體而言，對于谷氨酸依賴性菌株，學界更多認同的觀念是菌體靠合成酶將體外來源的谷氨酸單體直接聚合生成γ-PGA。

近年來，隨著分子生物學和代謝組學技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應用，γ-PGA合成相關(guān)的基因和酶系也逐步被認識。大量研究事實表明：γ-PGA的合成機理不同于普通蛋白質(zhì)的合成機理，缺少以RNA為模板的步驟，屬于非核糖體依賴類型的多肽合成。但相較于其他非核糖體依賴型多肽的合成，γ-PGA又呈現(xiàn)出特別之處，即產(chǎn)物具有高分子量，并且具有兩種不同的對映體。Man-Seok等研究了Bacillus subtilis strain DKUNT02的全基因組序列，用于鑒定其高活性γ-PGA的遺傳因子[14]。Naggi等研究發(fā)現(xiàn)納豆中枯草芽胞桿菌的質(zhì)粒不參與γ-PGA的合成[15]。如前文所述，對于γ-PGA合成機理的研究，探明D-谷氨酸如何產(chǎn)生，弄清聚合酶的存在與否是最需要解決的兩個關(guān)鍵問題。

4.4.2 生產(chǎn)菌種

據(jù)已有研究，γ-PGA的生產(chǎn)菌集中于芽孢桿菌屬，其中以枯草芽孢桿菌的研究最為透徹。也有研究發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)γ-PGA的炭疽芽孢桿菌[1]，但顯而易見的是炭疽芽孢桿菌并不適合作為工業(yè)生產(chǎn)菌。對于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，γ-PGA可以從培養(yǎng)基中較易分離得到，故而成為科研和生產(chǎn)的主要菌種。除了常見的芽胞桿菌以外，也有報道具備γ-聚谷氨酸合成能力的嗜鹽真菌，以及真核生物如水蛭的刺細胞[12]。

近年來可見一些有關(guān)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA衍生物、混合物的研究報道，拓寬了γ-PGA的應用范圍。有研究者發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌C1可以產(chǎn)生一種γ-PGA和甘油的結(jié)合物，而且作為非谷氨酸依賴型菌株，還具有生產(chǎn)成本較低的優(yōu)勢[3]。秦國宏等人利用枯草芽胞桿菌發(fā)酵實現(xiàn)γ-PGA和納豆激酶的聯(lián)產(chǎn)，且產(chǎn)量都達到了單獨合成時的水平[16]。

不同菌株的發(fā)酵對培養(yǎng)基成分的要求各異。需要提供外源性谷氨酸的為谷氨酸依賴型菌株，自身可以合成谷氨酸單體的為非谷氨酸依賴型菌株。谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌的γ-PGA產(chǎn)量較高，研究更為深入，例如B.licheniformis ATCC9945a和B.subtilis IFO3335。但從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考量，非谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌發(fā)酵更具吸引力，因此實際生產(chǎn)應用的需求促進了各國學者對非谷氨酸依賴型菌種的研究。

在高產(chǎn)菌種的選育研究中，傳統(tǒng)的物理和化學誘變技術(shù)多有應用。如李楠以納豆芽胞桿菌S004為出發(fā)菌，經(jīng)誘變選育后得到S004-50-01菌株，γ-PGA產(chǎn)量由原菌株的4.25 g/L提高到10.0 g/L，對谷氨酸的利用率由18.2%提高到42.83%[17]。隨著基因工程技術(shù)發(fā)展的不斷深入，其在微生物育種研究中應用越來越廣泛，對于γ-PGA高產(chǎn)菌的選育也不例外。Nagai等人將高產(chǎn)γ-PGA的編碼基因高頻率地轉(zhuǎn)換到無γ-PGA產(chǎn)生能力的菌株中，成功使其產(chǎn)生了大量的γ-PGA[18]。Chuan-Mei通過將調(diào)控序列導入BCA基因上游獲得了γ-PGA高產(chǎn)突變株[19]。相較于傳統(tǒng)的隨機誘變技術(shù)，基因工程手段的應用使育種技術(shù)得到了很大提升。

4.4.3 發(fā)酵方式

發(fā)酵方式通常以培養(yǎng)基的形態(tài)來分類，包括液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，其中前者更為常見。有研究將大豆作為γ-聚谷氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基，為固體發(fā)酵提供了研究素材[11]。該研究發(fā)現(xiàn)，大豆發(fā)酵還可以產(chǎn)生其他有用的代謝產(chǎn)物，例如維生素K2和納豆激酶等。固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基通?？梢灾苯硬捎锰烊晃镔|(zhì)，無需分離提純其中的營養(yǎng)成分，因此來源廣泛，工藝簡單，成本低廉。另外，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化相比于液體發(fā)酵來說較易。因此，固態(tài)發(fā)酵的應用前景非?？捎^。

值得一提的是，有研究者利用聯(lián)合發(fā)酵的巧思，大大提高了原料利用率，簡化了中間過程。聯(lián)合發(fā)酵即以前端發(fā)酵的產(chǎn)物作為后端發(fā)酵的培養(yǎng)基。研究選擇一種L-谷氨酸產(chǎn)生菌和一種γ-PGA產(chǎn)生菌，后者以前者的發(fā)酵產(chǎn)物L-谷氨酸為原料合成γ-PGA。前端發(fā)酵產(chǎn)生足量L-谷氨酸后，再將后端發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃、pH7.0培養(yǎng)24 h后，得到γ-PGA的最高產(chǎn)量為32.8 g/L[20]。偶聯(lián)發(fā)酵方式的開發(fā)，避免了谷氨酸提純的難題，提高了培養(yǎng)基的利用率，壓縮了生產(chǎn)成本。不過也面臨γ-PGA產(chǎn)量不高的弊端，需要進一步優(yōu)化。

4.4.4 發(fā)酵條件

除了篩選優(yōu)良菌種，還可以通過調(diào)節(jié)發(fā)酵條件來達到增產(chǎn)的目的。γ-PGA生產(chǎn)菌大多為芽孢桿菌，繁殖力強，適用于一般革蘭氏陽性菌的中性發(fā)酵條件[21]。培養(yǎng)基中碳源和氮源的濃度及比例是決定γ-PGA產(chǎn)量的核心因素，生長因子如Twee-80、二甲亞砜和甘油也可以促進γ-PGA的合成[22]。

4.4.4.1 谷氨酸

由于非谷氨酸依賴型菌株的γ-PGA產(chǎn)量較低，在現(xiàn)有科研及應用中更常見的是谷氨酸依賴型菌株。當外界提供的谷氨酸單體充足時，菌體利用γ-PGA合成酶將谷氨酸單體合成為γ-PGA，分泌至體外，在發(fā)酵液中不斷積累。由此可知，外源性谷氨酸的增加可以促進產(chǎn)物的積累。從微生物代謝的普遍規(guī)律來看，一方面，當原料谷氨酸單體的濃度增加到一定程度時，其利用率會緩慢降低，也就是說產(chǎn)物的增幅會減小[21]；另一方面，隨著發(fā)酵液中產(chǎn)物的不斷積累，過量的γ-PGA會反過來抑制其產(chǎn)生。因此，谷氨酸單體的添加量需要在平衡生產(chǎn)成本的前提下找到最優(yōu)值，而非越高越好。

4.4.4.2 碳源

碳源是菌體生長繁殖必需的元素，是培養(yǎng)基中最主要的成分。γ-PGA菌株發(fā)酵所需的碳源約是所合成的γ-PGA總量的2-20倍。常見的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉等都可以作為γ-PGA產(chǎn)生菌的碳源，已知的研究中葡萄糖和檸檬酸鹽應用較多。考慮到規(guī)?；a(chǎn)，宜用檸檬酸鹽做碳源，可降低成本[23]。楊革的研究也提到，檸檬酸是γ-PGA合成的最佳碳源[5]。不同的菌株對不同碳源的利用率各異，有利用單一碳源的菌株，也有將多種碳源按一定配比組合利用的菌株。

4.4.4.3 金屬離子

生物酶活性的高低往往與鹽離子息息相關(guān)。因此鹽離子也是影響γ-PGA的性質(zhì)的重要因素。菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成對金屬離子的需求可能不同。研究發(fā)現(xiàn)，錳離子對于枯草芽孢桿菌的繁殖必不可少，當錳離子濃度不斷升高，轉(zhuǎn)而益于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[5]。在Bacillus subtilis NX-2發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA中，研究者發(fā)現(xiàn)不同濃度的Mn2+還可以調(diào)控氨基酸異構(gòu)體的比例[24]。

4.4.4.4 溶氧

常見的γ-PGA高產(chǎn)菌株均為好氧菌，目前大多采用液體發(fā)酵模式。而液體發(fā)酵則面臨如何保持氧氣濃度的問題，尤其對于芽孢桿菌來說，代謝產(chǎn)物中的多糖導致發(fā)酵液黏度較高，隨著發(fā)酵產(chǎn)物的積累，液體傳質(zhì)效率越來越低，只能通過不斷加大人工通氧和增加攪拌來緩解。因此培養(yǎng)基利用率低，而生產(chǎn)成本高。有γ-PGA研究者成功轉(zhuǎn)化了貝氏硫桿菌中的血紅蛋白基因，解決了溶氧難題[11]。通過基因克隆的手段明顯提高了菌體發(fā)酵中的氧利用率，同時又不影響目標產(chǎn)物的生產(chǎn)和積累，達到了有效降低生產(chǎn)成本的目的。此法在γ-PGA的發(fā)酵生產(chǎn)中有望得到更多的研究與應用。

5 展望

縱觀各種γ-PGA合成方法，微生物發(fā)酵法是最具有科研和應用潛力的。但目前我國γ-PGA微生物發(fā)酵基本還處于實驗室研究階段，近年初步開始工業(yè)化試生產(chǎn)。試生產(chǎn)中難免遇到問題，通常為生產(chǎn)成本居高不下，生產(chǎn)效率卻提不上去。因此，高效、低成本的γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)亟待開發(fā)。譬如尋找廉價氮源代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨是一個改進的方向。近年來有研究者利用Bacillus subtilis發(fā)酵酒精生產(chǎn)廢液，提取γ-PGA，變廢為寶，增加了社會和經(jīng)濟效益。

生產(chǎn)中依然存在一些技術(shù)難題，例如由于發(fā)酵液黏度高而難以有效通氧和分離提純目標產(chǎn)物，大大制約了γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)能力的提升。此外，合成γ-PGA的常用菌在γ-PGA合成過程中其降解途徑也同時被啟動，反過來抑制產(chǎn)物的積累?，F(xiàn)如今，分子生物學技術(shù)的發(fā)展日趨成熟，在工業(yè)生產(chǎn)中的應用也越來越廣泛，通過基因克隆的方法構(gòu)建性狀優(yōu)良的γ-PGA工程菌，將有效解決現(xiàn)有的技術(shù)難題，為微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的壯大貢獻力量。

日本的氨基酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展旺盛，相關(guān)科研也走在國際領(lǐng)先水平[2]。相對而言，我國氨基酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展相對滯后，尤其在產(chǎn)品精深加工市場與國際領(lǐng)先水平存在明顯差距。國內(nèi)企業(yè)應加大科研投入，提高產(chǎn)品精加工能力，力求生產(chǎn)和出口精品，創(chuàng)造更多價值，而非始終拘于原料產(chǎn)品或者粗品市場。要重視科研，以加快微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的工業(yè)化步伐，為我國的氨基酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開拓更為廣闊的生存空間。