山核桃貝殼杉烯氧化酶基因CcKO的克隆和表達分析*

梁 璧 張佳琦 任 飛 胡恒康 徐川梅 胡淵淵 黃有軍 婁和強 張啟香

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

山核桃(Caryacathayensis)隸屬胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya)，是我國特有的優(yōu)質(zhì)干果和木本油料樹種，在主產(chǎn)區(qū)具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)價值(黃堅欽等，2002)。近年來，隨著生活水平的提高，人們對于山核桃的需求逐漸上升，產(chǎn)品供不應(yīng)求。然而，山核桃大多種植于山坡溝坎，因其樹體高大，管理十分困難，導(dǎo)致產(chǎn)量低、品質(zhì)差，同時，采收傷亡事件時有發(fā)生(俞飛飛等，2011)。因此，創(chuàng)制矮化或半矮化新種質(zhì)對于山核桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展十分重要。

赤霉素(gibberellins，GAs)作為一類植物激素，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，包括種子萌發(fā)、莖干伸長、開花誘導(dǎo)和果實發(fā)育等(Davièreetal.,2013；王弋等，2018；溫璐華等，2017)。研究表明，果樹的矮化受多種因素調(diào)控，其中內(nèi)源GAs含量的變化是重要原因之一。目前GAs突變體在果樹育種中的利用已證實人為調(diào)控GAs信號是實現(xiàn)果樹高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效方法之一(Dongetal.,2014)。GAs生物合成過程中受多種關(guān)鍵酶調(diào)控，如上游關(guān)鍵酶古巴焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶(ent-kaurene synthase,KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase,KAO)，以及下游關(guān)鍵酶GA20氧化酶(GA20-oxydase,GA20ox)、GA3氧化酶(GA3-oxydase,GA3ox)和GA2氧化酶(GA2-oxydase，GA2ox)等(Kaietal.,2016；Heddenetal.,2012；Shietal.,2018)。內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶KO是GAs合成上游的單基因調(diào)控酶，它是一個依賴于細胞色素P450和NADPH的單加氧酶，屬于CYP701家族，通過催化貝殼杉烯C19最后形成貝殼杉烯酸(Morroneetal.,2010)。研究表明，GAs合成過程中KO的失調(diào)表達是果樹株高變化的重要原因之一(王文然等，2017)。Davidson等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，在KO基因位點上發(fā)生阻塞會使豌豆(Pisumsativum)的下胚軸和節(jié)間變短，根的生長減少，葉片縮小。Helliwell等(1998)研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)ga3突變體可導(dǎo)致擬南芥種子不發(fā)芽、植株矮化、雄性不育等。Itoh等(2004)在水稻(Oryzasativa)中發(fā)現(xiàn)GA缺陷型半矮化突變體d35也是由于OsKO2位點變異引起。石琰景(2002)研究發(fā)現(xiàn)蘋果(Malusdomestica)M26矮化砧木的接穗中GAs含量減少，是由于砧木中KO的合成能力降低。此外，Mao等(2017)研究發(fā)現(xiàn)玉米(Zeamays)ZmKO同源基因在真菌感染時可大量表達，并參與其應(yīng)激反應(yīng)，推測可能在脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。Li等(2016)研究發(fā)現(xiàn)魯桑(Morusmulticaulis)MmKO基因的表達量與正常生長環(huán)境相比，在非生物脅迫條件下表達水平有顯著變化。Zhang等(2020)研究發(fā)現(xiàn)在水稻OsKO1突變體中淀粉合成和ABA信號感應(yīng)能力減弱，從而延緩種子萌發(fā)。這些研究結(jié)果為GAs生物合成及植物生長調(diào)控的研究提供了新的思路。

目前，已在擬南芥(Helliwelletal.,1998)、豌豆(Davidsonetal.,2004)、水稻(Itohetal.,2004)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)(Helliwelletal.,2000)、甜葉菊(Steviarebaudiana)(Humphreyetal.,2006)、玉米(Alexandrovetal.,2009)、黃瓜(Cucumissativus)(胡宏敏等，2012)等草本植物以及蘋果(田義軻，2004)、沙梨(Pyruspyrifolia)(李節(jié)法等，2010)、碧桃(Amygdaluspersicavar.persicaf.duplex)(石琰景，2002)等多年生果樹中相繼克隆獲得KO基因，然而，在果樹中，大多未對KO基因的表達進行深入分析。在胡桃科植物中，目前也未見對KO基因的克隆及功能分析。本研究以山核桃為試驗材料，通過KO基因全長及啟動子克隆、生物信息學(xué)分析以及遺傳轉(zhuǎn)化，以初步探究山核桃KO基因的生物學(xué)功能，旨在利用生物技術(shù)手段從基因水平調(diào)控山核桃的生長發(fā)育，為山核桃矮化/半矮化新種質(zhì)的分子輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)條件

以省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育的山核桃體細胞胚和核桃(Juglansregia)體細胞胚為試驗材料。培養(yǎng)條件為改良后的DKW 固體培養(yǎng)基，23 ℃暗箱培養(yǎng)。體胚再生植株在(25±2)℃、光照周期16 h/8 h、光照強度40～50 μmol·m-2s-1的組培室培養(yǎng)(胡恒康等，2011)。

1.2 山核桃KO基因編碼區(qū)全長及啟動子序列的克隆與載體構(gòu)建

山核桃體胚RNA的提取采用北京天根生化科技有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，DNA的提取采用杭州昊楓生物科技有限公司的Plant DNAzol植物基因組DNA快速提取試劑盒。在克隆過程中所用到的各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、PrimerSTAR高保真酶、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及后續(xù)陽性鑒定用的rTapDNA聚合酶均購自TaKaRa公司。

根據(jù)山核桃KO基因序列，設(shè)計相關(guān)引物(表1)。參照Saito等(2013)PCR擴增體系，并將PCR程序調(diào)整為94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，共32個循環(huán)；68 ℃延伸7 min(本研究中KO基因編碼區(qū)全長和啟動子克隆均采用同一PCR程序)，獲得山核桃KO基因編碼區(qū)全長(CcKO)和CcKO啟動子序列的片段。山核桃CcKO過表達載體構(gòu)建是將克隆的山核桃KO編碼區(qū)全長片段與帶有GFP報告基因的pC1300載體連接，載體酶切位點為BamHⅠ和SalⅠ(張佳琦等，2019)，所得載體命名為35S∷CcKO∷GFP；山核桃CcKO啟動子表達載體構(gòu)建是將克隆的山核桃KO啟動子片段與帶有GUS報告基因的pC1301載體連接，載體酶切位點為SalⅠ和NcoⅠ (Regnaultetal.,2014)，所得載體命名為CcKOpro∷GUS。將山核桃KO過表達載體和山核桃KO啟動子表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞，提取陽性單克隆菌株進行PCR鑒定，陽性菌株送至杭州有康生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果比對正確的菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后對單菌落進行PCR鑒定，正確的保菌用于后續(xù)試驗。

表1 引物序列①Tab.1 Primer sequence

1.3 山核桃CcKO基因及啟動子表達載體在核桃中的遺傳轉(zhuǎn)化及KO基因表達分析

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101中并擴大培養(yǎng)，測得OD值為1.0左右，根據(jù)公式計算離心的菌液量=(懸浮的體積×0.5)/(OD600×10)，5 000 r·min-1離心10 min，分別獲得山核桃KO過表達載體和山核桃KO啟動子表達載體的農(nóng)桿菌工程菌菌株。之后選取生長健壯的核桃體胚進行遺傳轉(zhuǎn)化(Walawageetal.,2014)。

將過量表達山核桃CcKO基因的核桃體胚置于體視熒光顯微鏡(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system，藍光 488 nm)下進行檢測，觀察體胚熒光激發(fā)情況；對具有綠色熒光GFP激發(fā)的核桃體胚進一步開展核桃轉(zhuǎn)化陽性體胚驗證，驗證方法同擴增PCR體系(引物參照表1)。經(jīng)鑒定為陽性的CcKO基因過表達體胚培養(yǎng)至子葉胚階段，干化處理3～5天后轉(zhuǎn)接于萌發(fā)培養(yǎng)基中進行植株再生，培養(yǎng)條件參考張啟香等(2011)。CcKO基因過表達植株萌發(fā)后進一步進行再生植株陽性驗證，并剪取生長健壯且長度相等的轉(zhuǎn)化植株的莖尖(1 cm)培養(yǎng)20天，觀察植株表型并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

將轉(zhuǎn)化山核桃CcKO啟動子的核桃體胚置于GUS染液中染色以檢測CcKO啟動子的陽性體胚。于37 ℃下染色8 h(Ruebetal.,1989)。陽性體胚進一步培養(yǎng)成再生植株，同樣的方法進行陽性植株鑒定并觀察其表型。

1.4 核桃陽性再生植株中KO及GA20ox、GA2ox基因的相對表達量檢測

分別選取生長健壯的對照植株和核桃35S∷CcKO∷GFP轉(zhuǎn)化植株3個株系的頂芽、葉片和莖，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR(qPCR)觀察KO基因在不同組織部位中的表達量以及KO基因過量表達對于GAs合成下游關(guān)鍵酶GA20ox和GA2ox的影響(定量引物參照表1，其中JrGA20ox和JrGA2ox參考設(shè)計的定量引物登錄號分別為：XM_018972764.1;XM_018969434.1)。qPCR反應(yīng)體系為10 μL，包含cDNA 0.4 μL，TB GREEN 5 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，RNase-freeWater 4.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。結(jié)果通過2-ΔΔCT法計算(Livaketal.,2011)。取樣的標(biāo)準(zhǔn)：頂芽為從最頂端開始1 cm處取樣，葉片為再生植株除頂芽外的葉片混樣，莖為再生植株中去除頂芽和葉的部分。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃KO基因編碼區(qū)全長及啟動子的克隆和序列分析

2.1.1 山核桃KO基因編碼區(qū)全長的克隆及過表達載體的構(gòu)建 以生長健壯的山核桃體胚為材料，提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，凝膠電泳顯示條帶在1 500 bp左右。連接pC1300-GFP載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進一步菌檢顯示條帶大小為1 500 bp左右，條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，測序比對正確后獲得山核桃KO基因的編碼區(qū)全長序列并將其命名為山核桃CcKO基因(Caca0733S0131)，構(gòu)建的CcKO基因過表達載體命名為35S∷CcKO∷GFP。

2.1.2 山核桃KO基因啟動子的克隆及載體構(gòu)建 以生長健壯的山核桃體胚為材料，提取DNA，并以DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶為2 000 bp左右，連接pC1301-GUS載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌檢條帶顯示在2 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致，測序比對后獲得山核桃KO啟動子的序列并將其命名為山核桃PCcKO啟動子，構(gòu)建的載體命名為CcKOpro∷GUS。

2.1.3 山核桃CcKO基因推導(dǎo)的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析 ORF Finder 軟件顯示山核桃CcKO基因開放性閱讀框(ORF)全長1 563 bp，編碼520個氨基酸(圖1)；ExPASy在線軟件顯示該基因所編碼的蛋白相對分子質(zhì)量59.076 kDa，等電點(pI)8.04，分子式C2673H4220N700O763S22；PSORT在線分析軟件顯示山核桃CcKO基因亞細胞定位34.8%位于線粒體，17.4%位于細胞質(zhì)，13%位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖1 CcKO的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Sequence of CcKO and its deduced amino acid sequence

BLAST比對發(fā)現(xiàn)山核桃CcKO基因?qū)儆诩毎爻易錚450系。山核桃CcKO基因編碼的氨基酸序列與核桃JrKO氨基酸(NW_017443530.1)同源性為96%，與歐洲栓皮櫟(Quercussuber)KO(NW_019812880.1)的同源性為79%，與板栗(Castaneamollissima)KO(AEF32084.1)的同源性為77%，與蘋果MdKO(AAS68017.2)的同源性為76%，與白梨(Pyrusbretschneideri)KO(NW_008988041.1)的同源性為71%。

將克隆的山核桃CcKO基因推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank 中已報道的其他物種的KO氨基酸序列進行同源性比對(圖2)，結(jié)果表明，山核桃CcKO具有真核生物CYP450的氧化還原位點PERF、底物結(jié)合域ETLR，以及距離羧基端52—61位氨基酸的血紅素結(jié)合域FGGGKRVCAG，該區(qū)域也是山核桃CcKO的半胱氨酸(C)亞鐵紅素結(jié)合位點。這與已報道的在沙梨(李節(jié)法等，2010)、黃瓜(胡宏敏等，2012)和野甘草(Scopariadulcis)(Yamamuraetal.,2018)中一致，說明該家族具有高度保守性。

圖2 不同物種KO氨基酸序列同源性比較Fig.2 Comparison of KO amino acid sequence homology among different species紅色方框內(nèi)為細胞色素p450特有的結(jié)構(gòu)域。In the red box are specific domains of cytochrome p450.Jr:核桃 Juglans regia;Os:歐洲栓皮櫟Quercus suber;Md:蘋果Malus domestica;Pb:白梨Pyrus bretschneideri;Cm:板栗Castanea mollissima;Hb:橡膠樹Hevea brasiliensis;Pm：梅Prunus mume;Cc:山核桃 Carya cathayensis.

2.2 山核桃PCcKO啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化及KO基因定位分析

選取生長健壯的核桃體胚進行遺傳轉(zhuǎn)化(該體胚記為E0代體胚，E0表面產(chǎn)生的新體胚記為E1代體胚，以此類推)，用制備好的CcKOpro∷GUS啟動子表達載體的農(nóng)桿菌菌液進行侵染，培養(yǎng)至E1、E2、E3代分別進行GUS染色。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GUS染液浸染8 h后部分轉(zhuǎn)化體胚呈現(xiàn)明亮的藍色，其中越靠近胚芽，染色越深(圖3A)，對照體胚無顯色反應(yīng)(圖3E)。統(tǒng)計結(jié)果表明，E1代體胚GUS陽性率為30%，E2代體胚GUS陽性率為50%，E3代體胚GUS陽性率為70%(表2)。進一步對E3代中GUS染色呈藍色的體胚進行PCR檢測(圖4A)，樣品獲得2 000 bp條帶，與預(yù)期大小一致，統(tǒng)計PCR陽性率為100%。待GUS陽性體胚萌發(fā)成完整植株，進一步對再生植株進行PCR檢測，條帶大小為2 000 bp的株系確定為陽性植株(圖4B)，統(tǒng)計結(jié)果表明陽性率為75%。對已鑒定的轉(zhuǎn)化植株莖葉進行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：陽性植株葉片的小葉葉脈處呈現(xiàn)明顯的藍色，其中主葉脈最為明顯(圖3B)，而對照植株葉片染色后無藍色(圖3F)。進一步對再生植株莖徒手切片橫切面GUS染色后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化的陽性植株莖橫切面維管束部位顯示明顯的藍色，而表皮、皮層和髓薄壁細胞藍色較淺；進一步對莖縱切面進行染色，同樣顯示維管束部位為明顯的藍色，而表皮、皮層和髓薄壁細胞顯色反應(yīng)較弱(圖3C、D)；對照植株莖橫切面和縱切面染色后無藍色(圖3G、H)。因此，推測該山核桃CcKO基因主要定位在維管束中。

圖3 核桃CcKOpro∷GUS陽性體胚及再生植株的GUS定位分析Fig.3 GUS localization analysis of CcKOpro∷GUS positive somatic embryos(SE) and regenerated plants(RP) in walnuts標(biāo)尺 Scale bar A,C,D,E,G,H:500 μm;B,F:100 μm.A:GUS陽性體胚；B:GUS陽性再生植株葉片；C:GUS陽性再生植株的莖橫切面；D:GUS陽性再生植株的莖縱切面；E:對照體胚；F:對照再生植株葉片；G:對照再生植株莖的橫切面；H:對照再生植株莖的縱切面。A:GUS positive SE;B:GUS positive RP leaves;C:Cross section of stem of GUS positive RP;D:Longitudinal section of stem of GUS positive RP;E:Control SE;F:Control RP leaves;G:Cross section of stem of control RP;H:Longitudinal section of stem of control RP.

表2 山核桃PCcKO在核桃體胚(SE)和再生植株(RP)中的陽性率統(tǒng)計①Tab.2 Statistics on the positive rate of PCcKO in walnut somatic embryos(SE) and regenerated plants(RP)

圖4 核桃 CcKOpro∷GUS陽性體胚及再生植株的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS transformed positive SE and RPM:5000 marker.A:核桃 CcKOpro∷GUS陽性體胚的PCR鑒定(1：對照體胚；2-7：陽性體胚)；B:核桃 CcKOpro∷GUS陽性再生植株的PCR鑒定(1-8:陽性再生植株；9:對照再生植株)。M:5000 Marker.A:PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS positive SE(1:Control SE;2-7:Positive SE)；B:PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS positive RP (1-8:Positive RP;9:Control RP).

2.3 山核桃CcKO基因在核桃中的遺傳轉(zhuǎn)化及表達分析

2.3.1 山核桃CcKO基因在核桃中的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性檢測 選取生長良好的核桃體胚進行遺傳轉(zhuǎn)化(圖6A)。用制備好的35S∷CcKO∷GFP過表達載體的農(nóng)桿菌工程菌液侵染核桃體胚。E0代體胚培養(yǎng)至2周左右，在子葉表面會出現(xiàn)顆粒狀E1代體胚。體視熒光顯微鏡下可以觀察到核桃體胚的發(fā)育經(jīng)歷了球形胚、心形胚、魚雷胚以及子葉胚階段(圖5)。在白光視野下，轉(zhuǎn)化體胚和對照體胚均呈白色透明狀。在藍光激發(fā)下，經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得的GFP陽性體胚表達出強烈的綠色熒光信號，而未轉(zhuǎn)化成功的體胚及對照體胚無熒光信號(圖5)。通過熒光檢測計算GFP體胚陽性率，結(jié)果顯示：E1代轉(zhuǎn)化體胚GFP陽性率為46%；將E1代GFP陽性體胚培養(yǎng)至E2代，GFP陽性率為65%；E3代的GFP陽性率為83%(表3)。

圖5 核桃35S∷CcKO∷GFP轉(zhuǎn)化體胚的熒光表達Fig.5 Fluorescence expression of walnut 35S∷CcKO∷GFP transformed SE標(biāo)尺 Scale bar D,H,L,P:100 μm；其余 The rest:500 μm.A,B,C,D:自然光下的轉(zhuǎn)化核桃體胚；E,F,G,H:藍光激發(fā)下的轉(zhuǎn)化核桃體胚；I,J,K,L:自然光下的對照核桃體胚；M,N,O,P：藍光激發(fā)下的對照核桃體胚。A,E，I，M:球形胚；B,F，J，N:心形胚；C,G，K，O:魚雷胚；D,H，L，P:子葉胚。A,B,C,D:Transgenic SE of walnut under natural light;E,F,G,H:Transgenic SE of walnut stimulated by blue light;I,J,K,L:Control SE of walnut under natural light;M,N,O,P:Control SE of walnut stimulated by blue light.A,E，I，M:Globular embryos;B,F，J，N:Heart-shaped embryos;C,G，K，O:Torpedo embryos;D,H，L，P:Cotyledon embryos.

表3 山核桃CcKO在核桃體胚(SE)不同培養(yǎng)代數(shù)中的陽性率統(tǒng)計Tab.3 Statistics of the positive rate of CcKO in walnut somatic embryos (SE) with different subculture

圖6 核桃35S∷CcKO∷GFP的陽性體胚及再生植株的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of positive SE and RP in walnut 35S∷CcKO∷GFPM:DL5000 marker;-：WT(陰性對照Negative control) ;+:35S∷CcKO∷GFP(陽性對照 Positive control).A：生長健壯的核桃體胚；B：GFP陽性體胚的PCR鑒定(1-8:轉(zhuǎn)化的核桃體胚)；C：轉(zhuǎn)化植株；D：轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定(1-8:轉(zhuǎn)化植株)。A:SE of walnut;B:PCR identification of GFP positive SE(1-8:Transformed walnut SE);C:Transgenic plants;D:PCR identification of transgenic plants(1-8:Transgenic plants).

為排除假陽性，進一步提取E3具有綠色熒光信號的體胚DNA進行PCR檢測，凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，大部分GFP陽性體胚條帶在1 500 bp左右，而少數(shù)GFP陽性體胚以及對照體胚無條帶(圖6B)，E3代PCR檢測陽性率為75%。將E3轉(zhuǎn)化體胚萌發(fā)成完整植株(圖6C)然后提取DNA進一步進行PCR檢測，將條帶大小與載體質(zhì)粒的條帶大小一致(1 500 bp)的株系確定為轉(zhuǎn)化陽性植株(圖6D)，統(tǒng)計結(jié)果表明陽性率為62.5%，對照植株無相應(yīng)條帶。

2.3.2 山核桃CcKO基因生物學(xué)功能的初步分析 1)CcKO基因過量表達對核桃轉(zhuǎn)化植株株高的影響 為了探尋山核桃CcKO基因過量表達與核桃再生植株株高之間的相關(guān)性，選取3個轉(zhuǎn)化陽性株系進行表型分析，3個株系分別命名為：35S∷CcKO∷GFP-1、35S∷CcKO∷GFP-2和35S∷CcKO∷GFP-3。截取相同長度(1 cm)的莖尖接入芽生長培養(yǎng)基(圖7A)，培養(yǎng)20天后測量植株的株高和節(jié)間長度(圖7B)。結(jié)果表明：與對照相比，3個陽性株系的株高均顯著增加，且葉片更大(圖7C、D)。其中，對照植株的平均株高17 mm，節(jié)間長4 mm；35S∷CcKO∷GFP-1陽性再生植株平均株高23.4 mm，比對照增加37.6%，節(jié)間長5.6 mm，比對照增加40.0%；35S∷CcKO∷GFP-2陽性再生植株平均株高22.5 mm，比對照增加32.4%，節(jié)間長5.4 mm，比對照增加35.0%；35S∷CcKO∷GFP-3陽性再生植株平均株高20.2 mm，比對照增加18.8%，節(jié)間長4.8 mm，比對照增加20.0%。

圖7 核桃35S∷CcKO∷GFP 轉(zhuǎn)化植株的表型分析Fig.7 Phenotypic analysis of 35S∷CcKO∷GFP transgenic walnut plants標(biāo)尺 Scale bar:10 mm.A,B:對照及轉(zhuǎn)化陽性植株分別在0 d和20 d的株高表型；C:對照及轉(zhuǎn)化陽性植株的葉片表型；D：株高及節(jié)間長統(tǒng)計分析，單因素方差分析顯著性，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。A,B:Plant height phenotypes of control and transgenic plants at 0 d and 20 d respectively;C:The leaf phenotypes of control and transgenic plants;D:Statistical analysis of plant height and internode length,significance of one-way ANOVA,different letters indicate significant difference (P<0.05).

2)CcKO基因過量表達對核桃轉(zhuǎn)化植株KO基因表達的影響 為了進一步研究過量表達山核桃CcKO基因?qū)颂以偕仓曛蠯O基因表達量及空間表達特征的影響，提取轉(zhuǎn)化陽性植株和對照植株的頂芽、葉和莖RNA，通過qPCR檢測核桃轉(zhuǎn)化陽性植株和對照植株中不同部位KO基因的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化植株中，各器官KOmRNA表達量均顯著高于對照，其中莖中KOmRNA表達量增加最多，為對照植株的5.3倍，葉和頂芽中表達量分別為對照植株的3.2倍和2.7倍。此外，KOmRNA表達具有明顯的空間差異，無論在轉(zhuǎn)化陽性植株還是對照植株中，KOmRNA的空間表達模式相似，即莖中的KOmRNA表達量均顯著高于頂芽和葉(圖8)。說明KO基因主要在莖中表達。

圖8 核桃轉(zhuǎn)化植株中CcKO的qPCR空間差異分析Fig.8 Spatial difference analysis of CcKO in transgenic walnut plants by qPCR單因素方差分析顯著性，*表示差異顯著(P<0.05)。Significance of one-way analysis of variance,* indicates significant difference (P<0.05).

3)CcKO基因過量表達對核桃轉(zhuǎn)化植株赤霉素合成下游關(guān)鍵酶基因的影響 為了研究赤霉素(GAs)合成通路中上游KO基因過量表達對下游關(guān)鍵酶基因的影響，本研究檢測了核桃35S∷CcKO∷GFP轉(zhuǎn)化植株不同部位JrGA20ox基因和JrGA2ox基因的相對表達量。結(jié)果表明：對照植株中，頂芽、葉和莖之間的JrGA20oxmRNA表達量差異不顯著。在核桃轉(zhuǎn)化陽性植株中，JrGA20ox表達量具有明顯的空間差異，其中在莖中的表達量顯著高于頂芽和葉片，表達量分別為頂芽和葉的2.1倍和2.3倍；頂芽和葉片中表達量差異不顯著。此外，與對照植株相比，轉(zhuǎn)化陽性植株頂芽和莖中JrGA20oxmRNA相對表達量顯著升高，分別為對照的3.1倍和2.6倍；葉中表達量與對照相比差異不顯著。由此，可以推測JrGA20ox表達趨勢與KO基因表達量一致，為正調(diào)控(圖9A)。

進一步對JrGA2ox基因的相對表達量進行檢測，結(jié)果表明，在對照植株中頂芽中的表達量顯著高于葉片和莖，其表達量為葉或莖的1.8～2倍，而葉和莖中表達量差異不顯著。在核桃轉(zhuǎn)化陽性植株中，JrGA2ox表達量具有明顯的空間差異，且表達量均顯著低于對照的相應(yīng)部位，其中在頂芽、葉片、莖的表達量分別僅為對照植株的7%、18%、51%。由此，可以推測JrGA2ox的表達趨勢與KO基因相反，為負(fù)調(diào)控(圖9B)。

圖9 CcKO過量表達對赤霉素合成下游關(guān)鍵酶基因的影響Fig.9 The effect of CcKO overexpression on key enzyme genes downstream of gibberellin biosynthesisA:核桃陽性再生植株中GA20ox基因的相對表達量;B：核桃陽性再生植株中GA2ox基因的相對表達量。利用單因素方差分析進行差異顯著性分析，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。A:The relative expression of GA20ox gene in walnut positive RP;B:The relative expression of GA2ox gene in walnut positive RP.Single factor analysis of variance is used to analysis the differences,and different letters indicate significant difference (P<0.05).

3 討論

赤霉素(GAs)作為植物生長調(diào)控的重要激素，它參與植物生長發(fā)育的整個過程。GAs缺乏易引起植物發(fā)育不良、矮化、雄性不育等現(xiàn)象(陳晶晶等，2014)，因此對植物GAs生物合成途徑中各個關(guān)鍵酶的研究顯得尤為重要。Faust(1992)研究認(rèn)為果樹樹形的改變是以GAs為中心的激素代謝不平衡造成的。朱海濤等(2008)也認(rèn)為GAs是控制樹體大小的最重要激素。KO是GAs生物合成途徑上游關(guān)鍵酶，也是植物GAs合成抑制劑多效唑(PP333)的靶酶，如果GAs生物合成途徑中在KO基因位點發(fā)生阻塞，也會影響植株的正常生長(Miyazakietal.,2011)。因此，研究GAs合成通路中KO基因的生物學(xué)功能對于調(diào)控果樹樹形及樹體大小具有十分重要的意義，并可為果樹種質(zhì)創(chuàng)新和分子輔助育種提供重要依據(jù)。

KO是GAs生物合成上游關(guān)鍵酶，催化GAs合成途徑的三步順序氧化反應(yīng)。本研究克隆獲得山核桃CcKO基因編碼區(qū)全長及啟動子PCcKO序列，將該基因的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，CcKO具有羧基端的血紅素結(jié)合域FGGGKRVCAG和氨基端的疏水結(jié)構(gòu)域PPVVPGLP以及氧化還原位點PERF，說明CcKO屬于細胞色素P450家族，這與在沙梨(李節(jié)法等，2010)、黃瓜(胡宏敏等，2012)和野甘草(Yamamuraetal.,2018)中的報道一致，說明細胞色素P450家族具有高度保守性。BLAST比對發(fā)現(xiàn)，CcKO編碼的氨基酸與核桃JrKO的同源性最高，為96%；與白梨、蘋果、板栗、歐洲栓皮櫟的同源性分別為71%、79%、77%、76%。此外，李節(jié)法等(2010)發(fā)現(xiàn)沙梨PpKO與蘋果MdKO在同一進化枝，且同源性最高達到95.9%；胡宏敏等(2012)發(fā)現(xiàn)黃瓜CsKO與苦瓜(Momordicacharantia)McKO氨基酸的同源性達到84%，與豌豆、草莓(Fragaria×ananassa)、擬南芥、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)的同源性分別為64%、61%、60%、63%，說明植株在進化過程中，親緣關(guān)系越近，同源性越高。

GAs合成關(guān)鍵酶基因的表達差異可導(dǎo)致植株株高的改變(石建斌等，2018)。Helliwell等(1998)、Davidson等(2004)和Itoh等(2004)分別在擬南芥、豌豆和水稻中發(fā)現(xiàn)KO基因突變均導(dǎo)致植株矮小，水稻過表達OsKO1基因可使突變體恢復(fù)表型(Zhangetal.，2020)。本研究通過異源轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)過量表達CcKO基因，可使核桃再生植株株高顯著高于對照，表明過量表達該基因可促進植株長高，該結(jié)論進一步驗證了前人的研究結(jié)果。此外，組織特異性研究表明，KO基因表達具有明顯的空間差異。擬南芥AtKO基因在所有組織中均有表達，其中在花序中表達量最高(Helliwelletal.,1998)；豌豆PsKO基因在根、莖和種子中均可表達(Davidsonetal.,2004；Itohetal.,2004)；黃瓜CsKO基因的表達量與下胚軸長度有關(guān)，表達量越高，幼苗的下胚軸越長(胡宏敏等，2012)；野甘草中SdKO主要在根和側(cè)根中表達，而根和側(cè)根屬于伸長組織(Yamamuraetal.,2018)。本研究中，qPCR結(jié)果顯示山核桃CcKO基因在核桃頂芽、葉和莖中均有表達，其中莖中表達量最高，其原因可能是KO參與GA12-醛的合成，而GA12-醛又是各種GA代謝的底物，因此會在核桃的各個組織表達(王西成等，2012)。GUS組織化學(xué)定位分析顯示CcKO啟動子能夠指導(dǎo)報告基因在核桃的葉脈和莖中表達，進一步徒手切片顯示該基因主要定位在維管束中。PlantCARE在線軟件分析發(fā)現(xiàn)CcKO啟動子包含G-box、I-box等光效應(yīng)順式作用元件及TATCCA序列。研究表明，TATCCA序列能夠結(jié)合MYB轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物初生和次生代謝、控制細胞的成長和分化以及參與植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程(楊郁文等，2012)。因此，初步推測山核桃CcKO基因主要是通過調(diào)控莖中維管組織的代謝和細胞生長，進而調(diào)控植株的生長發(fā)育。

KO通過一系列氧化作用，將貝殼杉烯形成貝殼杉烯酸，貝殼杉烯酸在貝殼杉烯酸氧化酶KAO的作用下形成GA53(Kaietal.,2016)。GA20ox和GA2ox是赤霉素生物合成途徑下游的關(guān)鍵酶，GA20ox能將GA12和GA53催化形成有活性的GA20和GA9，GA20ox表達量增加可使植株體內(nèi)GAs含量增加，從而促使植物生長加快(Giacomellietal.,2013)。GA2ox是GA降解過程的關(guān)鍵酶，它能維持體內(nèi)GAs的平衡，將具有生物活性的GAs和中間體分解失活(Wuddinehetal.,2015)。GA2ox過量表達會導(dǎo)致植株矮化，GAs含量降低。Ko等(2009)在體外酵母表達系統(tǒng)中驗證了KO能將貝殼杉烯形成貝殼杉烯酸，當(dāng)KO過量表達時，GA20ox氧化酶的表達量增加。宋楊等(2012)在不同時期提取‘長富2號’蘋果RNA并進行GA20ox和KO基因表達分析，發(fā)現(xiàn)其相對表達變化趨勢相似。在擬南芥ga1-3突變體中，GA20ox1表達量升高時，GA2ox的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(黃先忠等，2006)。本研究qPCR結(jié)果顯示：當(dāng)上游基因KO表達量增加時，下游基因GA20ox表達趨勢與KO一致，即表達量提高；GA2ox表達趨勢則相反，即表達量下降。因此，可以初步判斷山核桃CcKO基因與GA20ox表達正相關(guān)，與GA2ox表達負(fù)相關(guān)，進而協(xié)同調(diào)控植株的生長發(fā)育。

綜上，調(diào)控果樹樹體高度的因素很多，想要闡明其調(diào)控機制，需開展大量有關(guān)GAs合成路徑中其他關(guān)鍵酶及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等的研究。本研究克隆得到山核桃CcKO基因編碼區(qū)全長和PCcKO啟動子序列，并成功在核桃體胚中遺傳轉(zhuǎn)化，其結(jié)果為在分子水平上利用基因敲除、定向突變等手段研究KO的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)，同時也為果樹樹形調(diào)控提供了理論依據(jù)和技術(shù)手段。

4 結(jié)論

山核桃CcKO基因編碼區(qū)序列為1 563 bp，編碼520個氨基酸，該基因所編碼的氨基酸序列與核桃JrKO氨基酸序列同源性最高，同源性為96%。CcKO啟動子GUS染色結(jié)果表明，該基因主要定位于維管束中。核桃的遺傳轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明，KO基因mRNA在莖中相對表達量最高，表達豐度與株高呈正相關(guān)；在核桃再生植株中，KO基因與下游GA20ox基因正相關(guān)、GA2ox基因負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果為山核桃和核桃矮化/半矮化新種質(zhì)的分子輔助育種提供理論依據(jù)，也為進一步解析該基因在其他果樹中的生物學(xué)功能提供參考。