外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫下格木幼苗生理特性的影響*

孫明升 胡 穎 陳 旋 羅群鳳 楊章旗,

(1.廣西大學(xué)林學(xué)院 南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 南寧 530002)

格木(Erythrophleumfordii)為常綠喬木，國家二級重點保護樹種，分布于廣西、廣東、福建和臺灣等熱帶和南亞熱帶地區(qū)，是常綠闊葉林的重要組成部分。格木具有極高的經(jīng)濟、觀賞和生態(tài)價值，木材是高檔珍貴用材，具有材質(zhì)堅硬、強度大、耐水耐腐、抗蟲蛀、邊材心材區(qū)分明顯等特點，是家具制造、船舶工業(yè)和建筑業(yè)的理想用材(唐繼新等，2015；楊保國等，2017)，同時也是優(yōu)良的綠化和觀賞樹種，是生態(tài)公益林營建的重要樹種之一(趙志剛，2009)，格木分布區(qū)年降水量1 500～2 000 mm，相對濕度78%，年均溫19.2～22.1 ℃，但其對土壤要求較嚴(yán)苛，造林地宜選擇土層深厚、肥沃、濕潤的酸性砂壤土或輕黏土(韋菊玲，2018)。在干旱脅迫下，土壤的有效水分缺失，格木的葉片蒸騰失水得不到補償，致使原生質(zhì)脫水，細(xì)胞水勢不斷下降，膨壓降低，生長發(fā)育受到抑制(胡新生等，2009)。因此，探索緩解干旱脅迫帶給格木的傷害的方式，對格木的栽培和推廣具有重要意義。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以有效提高植物的抗逆性，如外施茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)能夠有效提高植株葉片的相對含水量、葉綠素含量以及抗氧化酶的活性，從而緩解干旱脅迫對植物造成的傷害(朱家紅等，2006；李紅利等，2009；Wuetal.，2012)。草莓(Fragaria×ananassa)葉片經(jīng)過MeJA處理能夠增加過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性及氨基酸的水平，從而提高其組織的抗旱性(Wang，1999)；在逆境情況下，噴施甜菜堿(betaine,BT)能降低細(xì)胞滲透勢，保護和維持生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性，甜菜堿及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的脯氨酸(PRO)能提高干旱脅迫下葉片的抗氧化能力，減輕過氧化損傷，保護細(xì)胞結(jié)構(gòu)(Arakawaetal.，1990；Sakamotoetal.，2000；Quanetal.，2010)；水楊酸(salicylic acid,SA)可誘導(dǎo)多種植物體內(nèi)H2O2積累而誘導(dǎo)發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng)，進而抵抗病毒、細(xì)菌及真菌性病害，在氣孔閉合和光合速率及相關(guān)滲透調(diào)節(jié)等方面具有重要的生理功能(Khanetal.，2003；Vlotetal.，2009；回振龍等，2014；葉松濤等，2015)。外施SA能提高茄子(Solanummelongena)種子吸水率和α-淀粉酶相對活性，增強茄子幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和抗氧化酶活性，緩解茄子在干旱脅迫下所遭受的氧化損傷，增強抗旱性(張小微等，2019)；SA浸種能夠抑制黑麥草(Loliumperenne)幼苗質(zhì)膜透性，促進保護酶活性提高，從而提高抗旱能力(劉杰等，2011)。Ca2+作為植物細(xì)胞偶聯(lián)細(xì)胞外信息和細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使參與干旱信號的傳遞，在啟動、調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)植物對干旱脅迫適應(yīng)機制的一系列生理生化反應(yīng)中具有重要作用(關(guān)軍鋒，2001；郭秀林等，2002；Xiongetal.，2002)。CaCl2溶液浸種和噴施葉片，能夠減緩棉花(Anemonevitifolia)水量散失，減緩葉綠素和保護酶降低幅度，并增加丙二醛(MDA)和膜透性，從而提高抗旱能力(程林梅等，1998)。

目前，對于格木響應(yīng)干旱脅迫的生理特性和提高抗旱能力的研究較少。本研究通過噴施不同濃度MeJA、BT、SA和 CaCl2溶液，研究格木幼苗在干旱脅迫下生理生化特性影響，探索利用外源物質(zhì)提高格木幼苗抗干旱能力的可行性，以期為格木的栽培和推廣提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法 格木幼苗來自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，為1年生實生苗。于2018年6月選取生長基本一致、無病蟲害、高50 cm左右的格木幼苗栽種于營養(yǎng)杯中，栽培基質(zhì)為營養(yǎng)土與蛭石以2∶1混合，基質(zhì)體積約為營養(yǎng)杯容積的80%，每盆1株。常規(guī)水肥管理，每5天澆水1次，培育1個月后進行外源調(diào)節(jié)物質(zhì)和干旱脅迫處理，在苗高54.3 cm左右、平均基莖為0.62 cm時，進行外源調(diào)節(jié)物質(zhì)和干旱脅迫處理。栽培和處理在廣西大學(xué)苗圃進行。

1.2 試驗設(shè)計 選用MeJA、BT、SA和CaCl24種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理格木幼苗，同時設(shè)置2組對照(CK)。CK1為置于正常土壤環(huán)境，噴施蒸餾水；CK2為置于濃度為30%的聚乙二醇(PEG-4000)溶液環(huán)境中，噴施蒸餾水。SA設(shè)25、100、200 mg·L-13個濃度；BT設(shè)100、500、1 000 mg·L-13個濃度；MeJA設(shè)0.1、1、3 mmol·L-13個濃度；CaCl2設(shè)5、20、40 mmol·L-13個濃度。于2018年7月9—11日，每日上午9:00對格木進行葉面噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，以葉片正反面浸潤、有液滴下落為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)噴施3天，每個處理有20棵格木幼苗。在處理結(jié)束后2 h，將幼苗連同營養(yǎng)杯放入濃度為30%的PEG-4000(北京索萊寶科技有限公司)干旱模擬溶液中進行干旱脅迫處理。干旱脅迫第10天，采取所有處理組合的每株格木幼苗相同部位的6～10個成熟羽狀復(fù)葉(幼苗中部)，進行相關(guān)生理指標(biāo)測定。

1.3 試驗方法 用試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)對可溶性蛋白、可溶性糖、PRO、MDA含量進行測定；對SOD、CAT、POD活性進行測定，用酶標(biāo)儀(Tecan公司生產(chǎn)的INFINITE 200 PRO，奧地利)測量吸光值；SPAD值測定采用手持便攜式葉綠素儀(Minolta公司生產(chǎn)的美能達SPAD-502，日本)進行測定。每處理選取3株長勢一致的格木幼苗，在同一部位選取3片長勢一致的葉片，共9片葉子，并將所有葉片做上標(biāo)記，每次測定同一片葉子。用葉綠素儀測定葉片讀數(shù)，在葉緣和葉脈中間無損傷的部位測定。同時，在測定部位上用打孔器取材，并將打孔圓片及時帶回實驗室采用電導(dǎo)儀法測定(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的DDB-303 A型便攜式電導(dǎo)率儀，中國)和計算相對電導(dǎo)率(李合生，2000)。所有指標(biāo)進行3次重復(fù)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行處理，用SPSS23.0對不同干旱脅迫下格木幼苗生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進行方差分析，用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法(LSD)多重比較分析不同脅迫水平之間各個參數(shù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對格木幼苗葉片細(xì)胞膜透性的影響 1) MDA含量變化 由表1可知：根據(jù)CK1與CK2，在正常水分供給情況下生活的植株，其MDA含量較低；在不噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的前提下，將格木置于干旱脅迫中，格木的MDA含量顯著上升(P<0.05)；噴施清水不能有效緩解干旱脅迫對格木幼苗造成的傷害，CK2格木幼苗葉片MDA含量相比CK1顯著增加228.19%。噴施4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后，格木幼苗葉片MDA含量較CK2均顯著降低，說明葉面噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)能顯著降低膜脂過氧化的程度，從而有效抵御干旱脅迫對格木幼苗的傷害。其中500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA、5 mmol·L-1的CaCl2處理效果最為顯著，相對于CK2分別降低33.20%、59.72%、50.88%和53.63%。

2) 相對電導(dǎo)率變化 由表1可知，CK2比CK1葉片相對電導(dǎo)率顯著升高195.82%(P<0.05)，說明干旱破壞了格木幼苗的細(xì)胞膜系統(tǒng)。噴施4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后，與CK2相比均不同程度降低格木幼苗葉片相對電導(dǎo)率，濃度為500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA、5 mmol·L-1的CaCl2處理的格木幼苗葉片相對電導(dǎo)率顯著下降，分別降低61.24%、56.65%、64.24%和47.76%。

2.2 干旱脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對格木幼苗葉片保護酶系統(tǒng)的影響 與CK1相比，在干旱脅迫下CK2的POD、SOD酶活性顯著降低(P<0.05)，分別降低48.96%和44.70%，表明干旱脅迫顯著抑制POD、SOD酶活性。與CK2相比，葉面噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)顯著提高格木幼苗葉片POD、SOD和CAT的活性，除CaCl2處理外，均隨著外源調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(表1)。與CK2相比，格木幼苗葉片抗氧化酶POD、SOD和CAT活性均為濃度500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA和5 mmol·L-1的CaCl2處理之后提高的效果最為顯著。噴施500 mg·L-1的BT，格木幼苗葉片POD、SOD 和CAT酶活性分別提高61.06%、70.06%、152.03%；噴施100 mg·L-1的SA，分別提高73.07%、88.82%、39.57%；噴施1 mmol·L-1的MeJA，分別提高128.50%、86.47%、139.22%；噴施5 mmol·L-1的CaCl2，分別提高90.40%、65.98%、46.35%。

表1 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫下格木幼苗葉片細(xì)胞膜透性、保護酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與葉綠素含量的影響①Tab.1 Effects of growth regulators on cell membrane permeability,protective enzyme system,osmoregulation substances and chlorophyll content in leaves of Erythrophleum fordii seedlings under drought stress

①同一列不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。The different letters within the same column mean the significance at the 0.05 level.

2.3 干旱脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對格木幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 1)PRO含量變化 由表1可知，格木幼苗經(jīng)干旱脅迫處理后，葉片中PRO含量較CK1顯著增加(P<0.05)，這說明干旱脅迫下格木幼苗能自發(fā)產(chǎn)生某種適應(yīng)干旱脅迫的機制，誘導(dǎo)并積累PRO，緩解干旱脅迫對自身造成的傷害。與CK2相比，對格木幼苗葉面噴施不同濃度的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)可明顯提高格木幼苗葉片PRO含量。經(jīng)500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA、5 mmol·L-1的CaCl2處理的格木幼苗，葉片PRO含量分別顯著提高69.38%、207.59%、166.83%、80.76%。

2) 可溶性蛋白含量變化 可溶性蛋白也是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由表1可知，干旱脅迫下，格木葉片可溶性蛋白含量的變化趨勢與PRO含量一致，可溶性蛋白含量與CK1相比明顯增加。除了CaCl2，隨著其他3種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)(BT、SA、MeJA)濃度的增加，均呈先升后降的趨勢。與CK2相比，葉面噴施500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA、5 mmol·L-1的CaCl2后，格木幼苗可溶性蛋白含量分別顯著提高126.22%、119.86%、102.20%、77.61%。

3) 可溶性糖含量變化 干旱脅迫下，格木葉片可溶性糖、PRO和可溶性蛋白含量的變化趨勢一致，可溶性糖含量與CK1相比明顯增加。除了CaCl2，隨著其他3種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)(BT、SA、MeJA)濃度的增加，處理后的葉片中可溶性糖含量均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。相對于CK2，葉面噴施500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA、5 mmol·L-1的CaCl2后，格木幼苗可溶性糖含量分別顯著提高158.77%、147.36%、120.23%、137.20%(表1)。

2.4 干旱脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對格木幼苗葉片葉綠素含量的影響 由表1可知，在經(jīng)干旱脅迫處理之后，格木幼苗葉片葉綠素含量顯著下降。與CK2相比，葉面噴施100 mg·L-1的BT、1 000 mg·L-1的BT、200 mg·L-1的SA、20 mmol·L-1的CaCl2和40 mmol·L-1的CaCl2都使SPAD值下降，其中噴施20和40 mmol·L-1的CaCl2更是使SPAD值顯著下降(P<0.05)；其他處理的SPAD值均不同程度上升，其中噴施500 mg·L-1的BT、100 mg·L-1的SA、1 mmol·L-1的MeJA和5 mmol·L-1的CaCl2后，SPAD值顯著上升，在本試驗涉及的各外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同濃度中，效果最顯著。

3 討論

3.1 干旱脅迫對格木幼苗的傷害 干旱可使格木幼苗萎蔫和生長抑制，長期干旱脅迫會導(dǎo)致原生質(zhì)嚴(yán)重脫水、生理生化代謝紊亂、減緩或停止細(xì)胞分裂，進而影響生長(胡新生等，2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，格木幼苗經(jīng)10天干旱脅迫后，與CK1相比，CK2格木幼苗葉片的MDA含量和相對電導(dǎo)率均顯著提高，可能是干旱脅迫使格木幼苗葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，引起電解質(zhì)外流。PRO、可溶性蛋白和可溶性糖含量的高低也能反映干旱脅迫傷害程度大小。CK2葉片的PRO、可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著高于CK1，一定程度上說明干旱脅迫對格木幼苗葉片造成了嚴(yán)重傷害；與CK1相比，CK2葉片POD、SOD活性顯著下降，可能是由于長期干旱脅迫抑制光合作用碳反應(yīng)的酶活性，導(dǎo)致葉綠體中有過多光能的積累，進而引起細(xì)胞大量產(chǎn)生活性氧(ROS)(劉強等，2014)。過量ROS超出細(xì)胞自身的系統(tǒng)清除能力，從而破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，致使細(xì)胞代謝紊亂，抑制抗氧化酶活性(蔣明義等，1994)。干旱脅迫下過量產(chǎn)生的ROS會破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)、損傷光合膜結(jié)構(gòu)，同時導(dǎo)致葉綠素降解，影響光合作用光反應(yīng)，使格木的光合能力下降，最終表現(xiàn)為CK2格木葉片SPAD值較CK1顯著下降。

3.2 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫下格木幼苗的滲透調(diào)節(jié)作用 滲透調(diào)節(jié)是植物響應(yīng)干旱的適應(yīng)性反應(yīng)。在干旱條件下，細(xì)胞會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持膨壓，以保持植物正常生理活動(Lietal.，2018)。長期干旱脅迫使植物體內(nèi)缺水，引起葉片及嫩枝的萎蔫甚至死亡(胡新生等，1998)。本研究發(fā)現(xiàn)，格木幼苗頂部新葉在干旱處理第2天就出現(xiàn)萎蔫，而格木幼苗下部葉片在干旱脅迫處理完成后仍沒出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫，這可能是因幼嫩的新葉比幼苗下部葉片對干旱脅迫更敏感。植物細(xì)胞缺水會促使植物主動積累PRO、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透物質(zhì)，以降低細(xì)胞滲透勢，增加細(xì)胞持水量。因此，干旱脅迫下格木幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量水平對維持體內(nèi)水分含量、減輕格木幼苗的干旱傷害具有重要意義。與CK2相比，干旱脅迫下用BT、SA、MeJA和CaCl2處理，PRO、可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著提高，4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)都使格木幼苗葉片細(xì)胞PRO、可溶性蛋白和可溶性糖含量增加，減少細(xì)胞水分損失，同時穩(wěn)定格木幼苗葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能，減輕膜脂過氧化程度，顯著降低格木幼苗葉片的MDA含量和相對電導(dǎo)率，提高格木幼苗的抗旱性。

3.3 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫下格木幼苗抗氧化酶活性的影響 POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)清除ROS和自由基的抗氧化酶，是植物抵抗逆境的第一道防線。干旱脅迫打破了植物細(xì)胞自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，進而出現(xiàn)ROS的過量積累，這種積累超過一定閾值就會破壞植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)生膜脂過氧化，導(dǎo)致植物死亡(孫國榮等，2003；柯世省等，2007)。抗氧化酶活性越高，植物對逆境的適應(yīng)能力就越強，本研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施一定濃度的MeJA、BT、SA和CaCl2能顯著提高干旱脅迫下格木幼苗葉片POD、SOD和CAT抗氧化酶活性。因此，可推斷4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的合適濃度可提高格木幼苗抗逆能力，增強干旱抵抗力。4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對抗氧化酶活性的誘導(dǎo)效果不同，可能是因其對格木的作用機制不同：BT是通過其對植物細(xì)胞內(nèi)大分子的保護作用來保護抗氧化酶和膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，維持其功能正常運行(郭啟芳等，2004)；SA可通過增加細(xì)胞內(nèi)保護酶的含量或提高其活性，在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)活性氧代謝，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，提高抗旱能力(孟雪嬌等，2010)；MeJA顯著誘導(dǎo)愈傷組織脂肪氧化酶(LOX)活性，并增加內(nèi)源JA和H2O2的含量，H2O2含量增加誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)酶活性的增加，包括：POD、SOD和CAT(馬超，2013)；當(dāng)植物受到外界脅迫時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，并與鈣調(diào)蛋白結(jié)合成激活態(tài)復(fù)合體，激活基因表達，啟動一系列反應(yīng)使植物適應(yīng)脅迫環(huán)境(Whiteetal.,2003；Kaderetal.，2010)。4種外源物質(zhì)通過其特有作用方式減少產(chǎn)生ROS，提高抗氧化酶的活性，維持植物體內(nèi)ROS代謝的平衡，以減輕干旱脅迫對格木幼苗的傷害。

3.4 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫下光合色素的保護作用 在干旱脅迫情況下，植物光能容易過剩，進而對植物器官存在潛在危害。光保護主要是依靠葉黃素循環(huán)所產(chǎn)生的熱耗散，同時為了阻止光合器官受損，酶促進與非酶促進系統(tǒng)也同時對此進行保護(裴斌等，2013)。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下的格木的光合特性指標(biāo)都呈下降趨勢，在開始復(fù)水后各項指標(biāo)上升(熊忻欣等，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK2相比，噴施一定濃度的MeJA、BT、SA和CaCl2能顯著提高格木幼苗葉片的SPAD值，可能是因BT保護光合作用的碳反應(yīng)酶和光合色素合成酶的結(jié)構(gòu)，使碳反應(yīng)能快速并順利進行(郭啟芳等，2004)；SA誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生和保護光合色素合成酶的活性；MeJA對干旱脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心有一定保護作用，提高了電子傳遞速率，并通過提高光合電子傳遞過程中的熱耗散能力減少過剩激發(fā)能的產(chǎn)生，減輕干旱給植物帶來的傷害(金微微等，2011)。外源Ca2+能在一定程度上彌補干旱脅迫導(dǎo)致的Ca2+虧缺，使植物維持較正常的生理活動，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與體內(nèi)離子吸收平衡，維持較高的光合速率并保護植物的光合結(jié)構(gòu)(李強等，2010)。一定濃度的4種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)通過對格木幼苗細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，最終可減少格木幼苗葉片細(xì)胞中ROS含量，避免ROS對葉綠體的破壞，在促進光合色素合成的同時，保護光合色素的結(jié)構(gòu)，使格木幼苗葉片細(xì)胞內(nèi)光合色素含量維持在較高水平，減輕干旱脅迫對格木幼苗的傷害。

4 結(jié)論

干旱是影響格木幼苗生長的重要環(huán)境脅迫因子之一，在格木栽培過程中應(yīng)采取措施降低干旱對格木樹苗傷害。為減少干旱脅迫危害，可在葉面噴施500 mg·L-1的甜菜堿(BT)、100 mg·L-1的水楊酸(SA)、1 mmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)或5 mmol·L-1的氯化鈣(CaCl2)，從而顯著降低格木幼苗葉片的MDA含量，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，減輕葉綠素下降趨勢，顯著提高POD、SOD和CAT等多種抗氧化酶活性，并最終提高苗木的抗干旱脅迫能力。