無(wú)損檢測(cè)技術(shù)在真菌鑒定及毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

武琳霞，翟文磊，韋迪哲，付海龍，王 蒙

（北京市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100097）

農(nóng)產(chǎn)品在收獲前和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中極易受真菌污染，導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降，且在適宜的條件下會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全[1]。農(nóng)產(chǎn)品中常見(jiàn)的真菌毒素包括曲霉菌（Aspergillus spp.）產(chǎn)生的黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）、青霉菌（Penicillium spp.）和曲霉菌產(chǎn)生的赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）以及鐮刀菌（Fusarium spp.）產(chǎn)生的伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)B）、脫氧雪腐鐮刀菌醇（deoxynivalenol，DON）、單端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）[2]。由于真菌毒素性質(zhì)穩(wěn)定，不易加工降解或去除[3]，因此，盡早發(fā)現(xiàn)真菌侵染，并采取有效的防控技術(shù)是延長(zhǎng)儲(chǔ)存期、保證產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全的重要措施。

目前，農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒真菌的常規(guī)鑒定方法主要依賴于特定的微生物和生化鑒定，主要有平板計(jì)數(shù)法、選擇性和鑒別培養(yǎng)基法、熒光分析法、微生物活性測(cè)定法、分子生物學(xué)方法等[3-4]。此外，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近年來(lái)興起的微生物快速鑒定分析技術(shù)[5]。真菌毒素通常含量較低，需要高效的提取富集和高靈敏的檢測(cè)技術(shù)。常用的方法是薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]。其他方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)、免疫親和檢測(cè)[6]、免疫熒光檢測(cè)[7]、適配體檢測(cè)[8]或者生物傳感器檢測(cè)等[2,6]。盡管這些方法準(zhǔn)確度較高，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高、效率低，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求[3]。而且這些方法會(huì)破壞樣品，在剔除不合格樣品的過(guò)程中會(huì)損失掉一定量的樣品。因此，建立一種快速、無(wú)損、低成本的檢測(cè)產(chǎn)毒真菌和真菌毒素污染的分析方法對(duì)促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和保證消費(fèi)安全具有重要意義。

目前，無(wú)損檢測(cè)技術(shù)在包括谷物、糧油、飼料、蔬菜水果、肉類、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛，但多用于檢測(cè)淀粉、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、水分、纖維素、維生素、可溶性固形物、葉綠素、多酚等樣品中含量較高的物質(zhì)。由于真菌或真菌毒素的污染量通常很小，還受到品種、地域等條件的影響，因此實(shí)現(xiàn)精確測(cè)定通常比較復(fù)雜。然而基于真菌或毒素對(duì)樣品中高含量成分的影響，通過(guò)無(wú)損檢測(cè)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行間接檢測(cè)在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，包括光譜學(xué)技術(shù)（如近紅外光譜、中紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜、太赫茲時(shí)域光譜）、成像技術(shù)（如高光譜及多光譜成像、彩色成像、熱成像、X射線成像）以及電子鼻技術(shù)等。本文綜述了無(wú)損檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒真菌及真菌毒素中的應(yīng)用和進(jìn)展，并介紹了其面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

1 光譜學(xué)技術(shù)

1.1 近紅外光譜法

紅外光譜法是測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品或食品中真菌及毒素污染的方法之一。其中，近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）是指介于可見(jiàn)光和中紅外光之間的電磁波，波長(zhǎng)范圍700～2 500 nm，一般有機(jī)物在該區(qū)域的近紅外光譜吸收主要是含氫基團(tuán)（—OH、—NH2、—SH）等的倍頻和合頻吸收[7]。因?yàn)榛诩t外光譜的方法靈敏度有限，目前無(wú)法在復(fù)雜的基質(zhì)（如食品）中直接測(cè)定包括真菌毒素在內(nèi)的污染物，而是通過(guò)由農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)在特征的變化而引起的紅外光譜中指紋區(qū)域的改變來(lái)進(jìn)行間接檢測(cè)[8]。

紅外光譜法在測(cè)定小麥[8-9]、大麥[8]、玉米[10-11]等中的真菌及毒素具有廣泛應(yīng)用（表1），分類及回歸模型預(yù)測(cè)精度均較高，但Dachoupakan Sirisomboon等[12]研究表明淀粉和水分含量對(duì)NIR測(cè)定可能產(chǎn)生較大影響。與傳統(tǒng)NIR相比，傅里葉變換近紅外光譜（Fourier transform near infrared spectroscopy，F(xiàn)T-NIR）通過(guò)干涉儀進(jìn)一步提高了光譜精度、再現(xiàn)性和波長(zhǎng)分辨率[13]。因此在玉米粉[14]、小麥[15-16]、稻谷[17]、糙米[18]、大米[19]、花生[20]等樣品中得到了廣泛的應(yīng)用。但這些方法多基于全波長(zhǎng)掃描及多波長(zhǎng)建模，為了建立高效的分類模型，Stasiewicz等[11]利用多光譜方法在9 個(gè)不同波長(zhǎng)處對(duì)AFT含量大于10 μg/kg和FB含量大于1 000 μg/kg的玉米粒進(jìn)行鑒別分析，結(jié)果可達(dá)到77%的靈敏度和83%的特異性。Falade等[10]表明在單波長(zhǎng)（2 198 nm）下，多元線性回歸模型可以區(qū)分不同成熟度玉米粒是否受黃曲霉侵染，模型決定系數(shù)（R2）可達(dá)0.88。NIR作為檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品理化性質(zhì)應(yīng)用最廣泛的光譜技術(shù)之一，由于其檢測(cè)效率高、成本低而成為一種有使用前景的產(chǎn)毒真菌和毒素污染的無(wú)損檢測(cè)方法。然而盡管許多研究將近紅外技術(shù)應(yīng)用于真菌及毒素的檢測(cè)，但并沒(méi)有明確地指出方法的檢測(cè)限[21]。由于FT-NIR具有較高的儀器穩(wěn)定性、光穿透深度和模型預(yù)測(cè)能力，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的無(wú)損檢測(cè)，但是儀器僅適用于靜態(tài)檢測(cè)分析，而不適用于工廠機(jī)械分選機(jī)中使用，因?yàn)闄C(jī)械振動(dòng)和溫度變化會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響[13]。

1.2 中紅外光譜法

中紅外光譜（mid infrared spectroscopy，MIR）的波長(zhǎng)范圍約為2 500～25 000 nm，依賴于基質(zhì)的分子振動(dòng)。電磁波譜的NIR和MIR波段都包含對(duì)生物大分子（蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等）中官能團(tuán)（例如羰基、酰胺基、酯基、醇羥基、亞甲基等）的選擇性信息。其主要區(qū)別在于MIR中的吸收對(duì)應(yīng)于分子振動(dòng)的基頻，而NIR中的吸收對(duì)應(yīng)于振動(dòng)的泛音和組合帶[18]。由于MIR測(cè)量的是基本振動(dòng)，因此可以獲得比NIR更加豐富的信息。

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）主要是應(yīng)用電磁光譜的MIR區(qū)（2 500～25 000 cm-1），通過(guò)監(jiān)測(cè)分子的基本振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)伸展，得到樣品的化學(xué)譜圖。del Girolamo等[16]通過(guò)FT-MIR對(duì)污染OTA的硬質(zhì)小麥樣品進(jìn)行了篩選。以2 μg/kg為閾值，PLS-DA和PC-LDA分類模型總的分類率都高于94%。Singh等[22]利用FT-IR同步輻射紅外成像技術(shù)研究?jī)?chǔ)藏小麥?zhǔn)芑揖G曲霉（A. glaucus）侵染后的成分變化，利用主成分得分的k-均值聚類可以清楚地區(qū)分正常樣品和污染樣品。Shen Fei等[18]利用FT-IR對(duì)于不同AFB1污染水平的糙米樣品進(jìn)行分類，LDA的正確分類率為96.9%。利用PLSR分別測(cè)定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量和總量時(shí)，也具有良好的預(yù)測(cè)精度（驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)r為0.922～0.970，RPD為2.5～4.0）?；贔T-IR無(wú)損分析技術(shù)，沈飛等[19]發(fā)現(xiàn)主成分分析（principal component analysis，PCA）-LDA對(duì)大米受不同霉菌感染及霉變狀態(tài)的識(shí)別率分別達(dá)到86.0%和87.5%。Kos等[23]利用FT-IR對(duì)被DON污染的玉米（以1 750 μg/kg為閾值）和被AFB1污染花生（以8 μg/kg為閾值）進(jìn)行分類，自助聚集（袋裝）決策樹(shù)方法分類準(zhǔn)確率分別為79%和77%。

表1 近紅外光譜技術(shù)在產(chǎn)毒真菌鑒定及毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Overview of the application of near infrared spectroscopy for identification of mycotoxin-producing fungi and mycotoxin detection

衰減全反射-傅里葉紅外光譜（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）是一種分子振動(dòng)光譜技術(shù)，它無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，能夠快速獲得樣品的光譜指紋特征。沈飛等[24]利用ATR-FTIR對(duì)小麥、面粉及面粉制品樣品中的DON含量建立了PLSR和逐步多元線性回歸（stepwise multiple linear regression，SMLR）的定量分析模型，結(jié)果顯示兩種方法均能較好預(yù)測(cè)樣品中的DON含量，預(yù)測(cè)集R2達(dá)0.86。沈飛等[25]還應(yīng)用ATR-FTIR將糙米按AFB1含量高低進(jìn)行分類，k近鄰算法（k-nearest neighbors，KNN）判別分析模型的預(yù)測(cè)整體正確率達(dá)到83.3%。運(yùn)用PLSR分析建立的定量模型預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)、RMSEP和相對(duì)分析誤差分別為0.970、70.8 μg/kg和4.0。Kaya-Celiker等[26]利用ATR-FTIR對(duì)常見(jiàn)的花生中曲霉屬真菌菌落數(shù)進(jìn)行了PLSR回歸分析，所得結(jié)果R2較高，為96.20%～99.98%，RMSE較低（0.014～0.153（lg（CFU/g）））。

近年來(lái)，量子級(jí)聯(lián)激光器（quantum cascade lasers，QCLs）被認(rèn)為是最先進(jìn)的光源，由于其體積小、輸出功率高、操作穩(wěn)定性強(qiáng)和廣泛的可調(diào)諧性（每個(gè)設(shè)備大于400 cm-1），有助于在便攜式MIR光譜和傳感器的中使用。Sieger等[27]利用中紅外可調(diào)諧QCL光譜對(duì)被DON污染的玉米和小麥樣品及被AFB1污染的花生樣品的分類，結(jié)果表明DON、AFB1含量分別以1 250 μg/kg和8 μg/kg為閾值時(shí)，利用PCA可進(jìn)行有效分離。

盡管MIR技術(shù)在定量分析研究中受到了許多研究者的青睞，但其準(zhǔn)確度仍然是一個(gè)需要解決的問(wèn)題[28-29]。可見(jiàn)-紅外光譜技術(shù)只關(guān)注樣品的一小部分，無(wú)法提供整個(gè)空間分布內(nèi)的樣品信息，因此難以應(yīng)用于顆粒較小樣品的無(wú)損檢測(cè)[30]。而且它適用于檢測(cè)污染物均勻分布的樣品，由于真菌及毒素在農(nóng)產(chǎn)品中的污染極其不均勻，這可能會(huì)影響方法的精度，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行多點(diǎn)檢測(cè)，以更好地預(yù)測(cè)樣品的總體污染水平。

1.3 熒光光譜法

當(dāng)熒光基團(tuán)（熒光結(jié)構(gòu)或熒光分子）吸收紫外線、可見(jiàn)光和紅外光后發(fā)射的光稱為熒光。當(dāng)熒光光基團(tuán)吸收特定波長(zhǎng)的能量時(shí)，分子就會(huì)釋放出更高波長(zhǎng)的能量[31]。熒光光譜作為一種無(wú)損、高靈敏度、特異性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)高效的分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)[13]。由于熒光光譜法只有在沒(méi)有或很低背景熒光成分存在的情況下才能進(jìn)行鑒定[32]，然而多種農(nóng)產(chǎn)品含有多種熒光成分，因此該方法對(duì)真菌毒素的測(cè)定較困難。為了能夠檢測(cè)樣品中真菌毒素的微弱熒光，激光誘導(dǎo)熒光光譜（laser induced fluorescence spectroscopy，LIFS）技術(shù)得到了發(fā)展應(yīng)用。這是由于LIFS在特定波長(zhǎng)和較窄的帶寬強(qiáng)光作用下，可以顯著增強(qiáng)熒光信號(hào)[33]。

Paghaleh等[33]研究表明紫外光源（308 nm）-LIFS可用于開(kāi)心果中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量測(cè)定，結(jié)果與高效液相色譜法一致。Wu Qingfang等[34]利用多光纖LIFS鑒別未污染AFB1和低污染水平（＜50 μg/kg）的開(kāi)心果，結(jié)果表明SVM和二階導(dǎo)數(shù)光譜相結(jié)合的三光源模式可得到高于97.0%的分類正確率?；?74～1 100 nm的SMLR模型對(duì)三光源LIFS具有最高的預(yù)測(cè)精度（RMSEP＜4.5 μg/kg）。Smeesters等[32]研究發(fā)現(xiàn)利用單光子誘導(dǎo)熒光和雙光子誘導(dǎo)熒光可以鑒定受AFT污染的玉米樣品。Cheng Xianbin等[35]在紫外-近紅外光譜（304～1 086 nm）范圍內(nèi)，利用反射和紫外激發(fā)熒光，掃描運(yùn)動(dòng)中的單粒玉米，利用RF分類模型對(duì)AFT總量是否超標(biāo)（20 μg/kg）的樣品進(jìn)行分類，訓(xùn)練集和測(cè)試集的分類準(zhǔn)確率均為97%以上。

由于檢測(cè)樣品的背景熒光成分常常會(huì)影響所獲得的熒光光譜，從而導(dǎo)致熒光峰混合或位移。因此，采用合適的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法處理熒光光譜數(shù)據(jù)顯得更為重要。

1.4 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)是基于化學(xué)鍵的極化率，較其他技術(shù)對(duì)分子非極性基團(tuán)中共價(jià)鍵的對(duì)稱振動(dòng)更為敏感，其操作簡(jiǎn)單、無(wú)損、快速、便攜、重復(fù)性、靈敏度高、不受水分子等干擾、很少有重疊帶，可以為定性和定量檢測(cè)真菌及其毒素的化學(xué)官能團(tuán)及其衍生物提供更多有價(jià)值的信息[7]。雖然紅外光譜和拉曼光譜都是振動(dòng)光譜，但與紅外吸收不同，拉曼光譜是基于光子與分子的能量交換。當(dāng)分子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，然后回到激發(fā)振動(dòng)態(tài)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生拉曼散射。增強(qiáng)拉曼效應(yīng)的技術(shù)包括受激拉曼散射、相干反-Stokes拉曼散射、共振拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced raman spectroscopy，SERS）。其中SERS技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，它結(jié)合了拉曼光譜和納米技術(shù)，通過(guò)使用金屬納米材料來(lái)提高傳統(tǒng)拉曼光譜的靈敏度和容量[36]。

Lee等[28]運(yùn)用拉曼光譜預(yù)測(cè)玉米中的AFT含量，PLSR和多元線性回歸模型的預(yù)測(cè)R2均在0.94以上。Yuan Jing等[37]建立了基于SERS快速檢測(cè)谷物中DON的方法，并將建立的方法應(yīng)用于玉米、蕓豆和燕麥中DON的檢測(cè)，結(jié)果表明利用便攜式拉曼系統(tǒng)和銀納米粒子在短時(shí)間內(nèi)能成功地檢測(cè)到玉米中濃度為100 nmol/L的DON。同時(shí)蕓豆和燕麥中DON的檢測(cè)限分別為10-6mol/L和10-4mol/L。Mignani等[38]利用拉曼光譜，以DON含量是否高于400 μg/kg對(duì)小麥麩皮樣品進(jìn)行分類，結(jié)果表明KNN分類準(zhǔn)確率為82%。拉曼光譜可以以其無(wú)損、快捷、無(wú)污染、低干擾、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)應(yīng)用到實(shí)際生活的各類檢測(cè)中，利用其進(jìn)行真菌及毒素?zé)o損檢測(cè)是一個(gè)新興的思路和探究方向，具有一定的研究?jī)r(jià)值和前景。但拉曼光譜受信號(hào)強(qiáng)度的限制，因?yàn)榕c近紅外和中紅外吸收光譜相比，拉曼散射受樣品熒光的影響很大，因此需要對(duì)拉曼光譜熒光干擾進(jìn)行校正，需要高穩(wěn)定性的激光光源和靈敏的放大設(shè)備來(lái)檢測(cè)易受生物熒光干擾的微弱信號(hào)，這也使得拉曼儀器的成本更高[30]；因此今后的工作重點(diǎn)應(yīng)放在開(kāi)發(fā)低成本的激光光源和放大儀器上。應(yīng)用拉曼光譜的另一個(gè)限制是當(dāng)其用于固體或非均質(zhì)樣品分析時(shí)，許多因素，如顏色、吸光度和粒度，都會(huì)影響固體樣品的拉曼光譜測(cè)定。而且拉曼光譜主要應(yīng)用于體積較小的樣品且靈敏度較低，限制了該技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用[8]。

1.5 太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)

太赫茲技術(shù)波介于毫米波和紅外光之間，屬于遠(yuǎn)紅外波段，是一個(gè)非常具有科學(xué)研究?jī)r(jià)值的電磁波輻射區(qū)域。研究表明，分子之間弱的相互作用如氫鍵、范德華力、偶極的旋轉(zhuǎn)和振動(dòng)躍遷以及晶格的低頻振動(dòng)吸收只有在太赫茲波段才能有所響應(yīng)[39]。太赫茲時(shí)域光譜（terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）技術(shù)是基于飛秒超快激光技術(shù)遠(yuǎn)紅外波段光譜測(cè)量的新技術(shù)，可以有效反映有機(jī)生物分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，作為物質(zhì)“指紋”譜，該技術(shù)逐漸應(yīng)用于有機(jī)生物分子的定性、定量分析，在近紅外光譜、拉曼光譜、X射線等眾多光譜類快速無(wú)損檢測(cè)技術(shù)中成為一種極具競(jìng)爭(zhēng)力的新興檢測(cè)技術(shù)[40]。

廉飛宇等[41]根據(jù)AFB1溶液在不同頻率范圍內(nèi)光學(xué)參數(shù)（主要是折射率和吸收系數(shù)）的不同，利用太赫茲光譜對(duì)其進(jìn)行定性分析，并利用最小二乘支持向量機(jī)對(duì)其進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，利用THz-TDS能夠?qū)θ芤褐蠥FB1濃度進(jìn)行精確識(shí)別。Ge Hongyi等[42]利用太赫茲光譜法測(cè)定質(zhì)量濃度范圍為1～50 μg/mL和1～50 μg/L AFB1乙腈溶液的太赫茲光譜，并對(duì)其在0.4～1.6 THz的頻率范圍進(jìn)行了分析。利用不同的方法建立樣品吸收光譜與質(zhì)量濃度之間的非線性回歸模型，結(jié)果表明，PLS和主成分回歸模型在1～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)擬合較好，而SVM和PCA-SVM在1～50 μg/L范圍內(nèi)擬合較好。此外，還對(duì)10 個(gè)從霉變玉米中提取的未知AFB1質(zhì)量濃度樣品進(jìn)行了定量分析，其最小誤差范圍為0.76～2.39 μg/L。雖然THz-TDS是一個(gè)在化合物定性與定量分析中很有應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)，但目前在農(nóng)產(chǎn)品真菌及毒素檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少，且目前多以真菌毒素溶液為研究對(duì)象，較少研究能夠真正實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)。

2 成像技術(shù)

2.1 高光譜及多光譜成像技術(shù)

在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域，高光譜成像（hyperspectral imaging，HSI）是一種能夠表征復(fù)雜基質(zhì)特性的新興技術(shù)，得到了廣泛地應(yīng)用。HSI也稱為化學(xué)或光譜成像，它能夠?qū)鹘y(tǒng)成像和光譜學(xué)結(jié)合起來(lái)，獲得研究對(duì)象的空間和光譜信息。HSI是由數(shù)百個(gè)連續(xù)的波段組成，這些波段對(duì)應(yīng)于不同空間位置樣本對(duì)應(yīng)的光譜。HSI可在紫外、可見(jiàn)光和近紅外區(qū)域（300～2 600 nm）范圍內(nèi)獲得樣品的空間和光譜信息[43]。針對(duì)不同類型樣品，開(kāi)發(fā)了針對(duì)多電磁波譜的HSI技術(shù)如紫外（200～400 nm）、可見(jiàn)光（380～800 nm）、可見(jiàn)光/近紅外（400～1 000 nm）、近紅外（900～1 700 nm）和短波紅外（970～2 500 nm），其中后3 種技術(shù)常用于農(nóng)產(chǎn)品[36]。近幾年的研究表明，利用高光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中的產(chǎn)毒真菌或真菌毒素的快速、無(wú)損檢測(cè)具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在檢測(cè)方法上，高光譜反射、高光譜熒光、高光譜可見(jiàn)近紅外光譜（visible-near infrared spectroscopy，VNIR）和高光譜短波近紅外光譜（shortwave infrared spectroscopy，SWIR）都是檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中真菌及毒素的常用且有效的方法。但樣品的水分、蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等組分可能會(huì)影響HSI對(duì)真菌毒素的預(yù)測(cè)精度，特別是利用SWIR-HIS檢測(cè)時(shí)[44]。盡管樣品水分含量對(duì)VNIR-HIS的光譜信號(hào)無(wú)顯著影響[45]，但由于短波近紅外成像系統(tǒng)（電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機(jī)）的成本遠(yuǎn)低于長(zhǎng)波近紅外成像系統(tǒng)（如銦鎵砷（InGaAs）相機(jī)），近幾年來(lái)越來(lái)越多的研究開(kāi)始利用SWIR-HSI對(duì)真菌及毒素進(jìn)行檢測(cè)[46]。熒光HSI技術(shù)是為了獲得高光譜和高空間分辨率的熒光圖像數(shù)據(jù)而發(fā)展起來(lái)的，其圖像具有與VNIR-HSI圖像相似的高光譜和空間分辨率[47]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于玉米[47-51]、花生[52]、開(kāi)心果[53]等產(chǎn)品中AFT和產(chǎn)毒真菌的檢測(cè)。然而，由于發(fā)射響應(yīng)的限制，即使在成像中使用較長(zhǎng)的數(shù)據(jù)采集時(shí)間，熒光圖像的強(qiáng)度通常也遠(yuǎn)低于VNIR-HSI圖像的強(qiáng)度[47]。

HSI需要在較寬的光譜區(qū)域內(nèi)，在狹窄和相鄰的波長(zhǎng)或波段上獲得成千上萬(wàn)個(gè)光譜圖像，而多光譜成像技術(shù)（multispectral imaging，MSI）是通過(guò)成像光譜儀或?yàn)V光片在不同寬度和間距的離散波段進(jìn)行采樣，僅具有少數(shù)幾個(gè)重要的波段信息[13]。作為HSI的一種簡(jiǎn)化形式，MSI被越來(lái)越多地應(yīng)用于各種農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒真菌和真菌毒素的檢測(cè)。Kalkan等[54]利用MSI判別榛子和辣椒粉是否受AFT污染，結(jié)果表明二維局部判別基（local discriminant bases，LDB）算法對(duì)榛子（以4 μg/kg為閾值）和紅辣椒（以10 μg/kg為閾值）的分類準(zhǔn)確率分別為92.3%和79.17%。再將該算法對(duì)是否受真菌污染的榛子仁進(jìn)行分類，分類準(zhǔn)確率達(dá)95.67%。Kalkan等[55]使用熒光MSI來(lái)區(qū)分正常無(wú)花果和AFT污染無(wú)花果，結(jié)果的錯(cuò)誤率較低，分別為9.38%和11.98%。HSI的主要缺點(diǎn)是體積大、設(shè)備成本高、計(jì)算量大，需要復(fù)雜的處理算法，降低了計(jì)算速度。因此，有必要通過(guò)定性和定量分析來(lái)尋找最佳波段。通過(guò)對(duì)選定波段的確定，可以開(kāi)發(fā)出一種通用孔徑多光譜系統(tǒng)，在降低成本和縮短分析時(shí)間的同時(shí)，提高計(jì)算速度，以滿足在線或?qū)崟r(shí)應(yīng)用的需要。此外，真菌和毒素污染并不是在一個(gè)批次內(nèi)所有樣品和位置均勻發(fā)生，因此，相對(duì)低速的HSI和MSI在有效評(píng)估整個(gè)樣本方面仍然存在許多挑戰(zhàn)，HSI系統(tǒng)的硬件速度有待進(jìn)一步提高，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量高光譜數(shù)據(jù)的快速采集和分析。

在硬件設(shè)施改進(jìn)的基礎(chǔ)上，高光譜技術(shù)的建模算法也在不斷地改進(jìn)。HSI提供了有關(guān)樣本的詳細(xì)信息，然而使用相關(guān)而冗余的波長(zhǎng)可能會(huì)降低分類的準(zhǔn)確性。因此在合理范圍內(nèi)減少特征向量的維數(shù)不僅可以提高分類器的性能，而且可以提高計(jì)算速度，從而更好地解決問(wèn)題[56]。最常用的特征向量選擇方法是PCA，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，更多簡(jiǎn)潔且高性能的特征向量選擇算法得到應(yīng)用，例如對(duì)比連續(xù)投影算法（successive projections algorithm，SPA）[57-59]、非參數(shù)加權(quán)特征提?。╪onparametric weighted feature extraction，NWFE）[60]、基于MLP連接權(quán)值顯著性度量[56]、SFFS[61]、改進(jìn)格拉姆斯密特算法（modified Gram-Schmidt，MGS）與遺傳無(wú)信息變量消除算法（genetic uninformative variable elimination，GAUVE）[62]等方法能有效地提取特征波長(zhǎng)，進(jìn)而建立最高效、準(zhǔn)確的模型。表2總結(jié)了目前HSI技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒真菌鑒定或毒素檢測(cè)的建模方法，其中常用PLS-DA[63]、因子判別分析（factorial discriminant analysis，F(xiàn)DA）[64-65]、LDA、二次判別分析（quadratic discriminant analysis，QDA）、馬氏統(tǒng)計(jì)判別模型[46,66-67]、SVM[62]、光譜角制圖（spectral angle mapper，SAM）[68-69]都具有較高的有效性和準(zhǔn)確性，但這些研究主要以單粒樣品為研究對(duì)象，多集中在光譜信息的分類和識(shí)別，而空間信息被忽略。Qi Xiaotong[59]和Jiang Jinbao[70]等則分別利用聯(lián)合稀疏表示模型（joint sparse representation based classification，JSRC）和帶標(biāo)記控制的分水嶺算法能夠利用空間信息從而識(shí)別圖像中受污染像素（部分顆粒）的分布。此外，常用的PLSR、多元線性回歸（multiple linear regression，MLR）、主成分回歸（principal component regression，PCR ）、SVM、KNN等均是有監(jiān)督的學(xué)習(xí)算法，即對(duì)數(shù)據(jù)集的正確輸出已知情況下的一類學(xué)習(xí)算法。而Siripatrawan等[71]首次利用無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法——自組織映射網(wǎng)絡(luò)（self-organizing map，SOM）對(duì)糙米粒受真菌感染的不同程度進(jìn)行分類，并通過(guò)圖形可視化，為無(wú)損檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路。未來(lái)的研究應(yīng)該更多地結(jié)合空間信息，在單粒樣品的基礎(chǔ)上確定嚴(yán)重污染的部位，以防將部分嚴(yán)重污染樣品直接認(rèn)定為正常樣品。且非監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法不需要預(yù)先對(duì)所要分類的區(qū)域進(jìn)行深入了解，從而降低人為誤差的概率，因此將會(huì)是未來(lái)研究的發(fā)展趨勢(shì)。

表2 高光譜和多光譜成像技術(shù)在產(chǎn)毒真菌鑒定及毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Overview of the application of hyperspectral imaging and multispectral imaging techniques for identification of mycotoxin-producing fungi and mycotoxin detection

續(xù)表2

2.2 彩色成像技術(shù)

與正常農(nóng)產(chǎn)品相比，受真菌侵染的農(nóng)產(chǎn)品特性發(fā)生改變，例如品質(zhì)降低與物理特性的變化，包括顏色變淺、質(zhì)量降低等。應(yīng)用彩色成像技術(shù)可以精確地捕捉到這些變化[84]。彩色成像技術(shù)提取到的彩色圖像特征包括紅綠藍(lán)顏色直方圖、強(qiáng)度、色調(diào)范圍、飽和度和由灰度共生矩陣得出的紋理特征，利用適當(dāng)?shù)膱D像處理算法進(jìn)行產(chǎn)毒真菌或毒素污染的預(yù)測(cè)。彩色成像的優(yōu)點(diǎn)是可以分析整個(gè)樣品表面以及量化表面特性[85]。

彩色成像技術(shù)已應(yīng)用于檢測(cè)小麥[46,84]和玉米中的真菌侵染[86]。Tallada等[86]利用彩色成像技術(shù)鑒別了8 種真菌在不同侵染水平下對(duì)玉米粒的污染情況，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的正確識(shí)別率均為75%。但該技術(shù)對(duì)不同真菌種類的分離效果并不理想。這可能是由于彩色成像獲得光學(xué)數(shù)據(jù)的電磁波范圍有限，而樣品的物理變色是造成光學(xué)數(shù)據(jù)差異的唯一來(lái)源，因此，在侵染一段時(shí)間之后進(jìn)行彩色成像應(yīng)該更有效。Singh等[46]從感染真菌和正常小麥籽粒的彩色圖像中提取了179 個(gè)特征（顏色和紋理）。之后利用逐步判別分析選定10 個(gè)特征參數(shù)，運(yùn)用LDA、QDA和馬氏判別分類法，對(duì)樣品的正確分類率分別為94.3%、90.3%和89.3%。Jirsa等[84]利用LDA鑒別小麥?zhǔn)欠袂秩剧牭毒?，結(jié)果表明基于顏色參數(shù)（紅、綠、藍(lán)）結(jié)合色調(diào)可以獲得較好的判別效果，模型分類準(zhǔn)確率為85%。與HSI系統(tǒng)相比，彩色數(shù)碼相機(jī)成本較低，但對(duì)早期真菌鑒別效果不是很理想。

2.3 熱成像技術(shù)

熱成像是基于所有材料都發(fā)射紅外輻射的特點(diǎn)，其可根據(jù)輻射量產(chǎn)生物體表面熱分布的圖像[87-88]。通過(guò)在一個(gè)區(qū)域上測(cè)量多個(gè)點(diǎn)的溫度，并將其處理成物體表面的熱圖或譜圖，再經(jīng)過(guò)圖像處理技術(shù)分析熱圖[89]，從而提取統(tǒng)計(jì)特征和紋理特征以進(jìn)行樣品分類。

Chelladurai等[90]采用非致冷紅外焦平面陣列熱像儀對(duì)是否受A. glaucus、A. niger和Penicilliumspp.侵染的小麥樣品進(jìn)行熱成像分析，LDA和QDA分類模型對(duì)未污染樣品的分類準(zhǔn)確率可達(dá)100%，對(duì)污染樣品的分類準(zhǔn)確率可達(dá)97%和96%。而該方法無(wú)法區(qū)分不同真菌種類，這是由于受不同真菌侵染的小麥在化學(xué)成分上的變化相似。熱成像技術(shù)的局限性包括加熱和冷卻過(guò)程可能會(huì)改變熱敏性產(chǎn)品的性質(zhì)，熱分布的變化有可能會(huì)影響熱圖。

2.4 X射線成像技術(shù)

X射線是波長(zhǎng)約為0.01～10 nm的電磁輻射，它可以穿過(guò)物質(zhì)，產(chǎn)生的圖像可以直接反映內(nèi)部缺陷以及內(nèi)部密度和結(jié)構(gòu)的變化[87]。X射線成像和計(jì)算機(jī)斷層掃描是基于X射線衰減的差異，這種差異則主要是由被檢測(cè)樣品的密度差異引起的。由于真菌侵染可以引起農(nóng)產(chǎn)品密度變化，這種變化可以通過(guò)從正常和受侵染樣品的X射線圖像中通過(guò)特征比較與提取來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[91]。

Orina等[92]利用高分辨率X射線顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（50 kV、250 μA）研究了玉米粒受黃萎病鐮刀菌（F.verticillioides）侵染后顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。感染玉米粒和正常玉米粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化可以在二維和三維圖像中顯示出來(lái)，并根據(jù)籽?？傮w積、空隙空間總體積和平均灰度進(jìn)行量化。隨著時(shí)間的推移，玉米粒總體積和平均灰度減小，空隙總體積增大。與其他成像技術(shù)相比，X射線成像具有明顯的優(yōu)勢(shì)，例如它允許對(duì)樣品內(nèi)部特征進(jìn)行無(wú)損成像，以檢測(cè)隱藏的缺陷或污染。X射線微計(jì)算機(jī)斷層成像的局限性在于它成本高，需要長(zhǎng)時(shí)間的圖像分析過(guò)程[93]。

3 電子鼻技術(shù)

產(chǎn)毒真菌在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中會(huì)伴隨著一些揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生，如醇類、醛類、酮類和酯類。電子鼻由一系列非特異性化學(xué)傳感器組成，這些傳感器可與不同的揮發(fā)性化合物相互作用，并生成信號(hào)，可作為被分析樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的指紋信息，再通過(guò)模式識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別或定量揮發(fā)性物質(zhì)[94]。因此電子鼻也被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)毒真菌鑒定及毒素含量的測(cè)定。

電子鼻技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用在小麥、玉米、大米及花生等真菌和毒素的分類鑒別與定量預(yù)測(cè)。Campagnoli等[94]采用PCA和分類回歸樹(shù)算法將被DON污染的硬質(zhì)小麥樣品分為3 類：未污染樣品、污染含量低于限值（1 750 μg/kg）的樣品、污染含量高于限值的樣品，預(yù)測(cè)錯(cuò)誤率分別為0%（20 個(gè)樣本集）和3.28%（122 個(gè)樣本集）。當(dāng)將小麥粉按DON污染程度（DON含量＜1 000 μg/kg、1 000 μg/kg≤DON含量≤2 500 μg/kg和DON含量＞2 500 μg/kg）進(jìn)行分類時(shí)，判別函數(shù)分析類準(zhǔn)確率可達(dá)為82.1%[95]。在玉米樣品的檢測(cè)中，于慧春等[96]通過(guò)比較PCR、PLSR、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、最小二乘支持向量機(jī)對(duì)ZEN與AFB1含量的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和最小二乘支持向量機(jī)法較好且具有較高的穩(wěn)健性。之后，其利用電子鼻融合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)不同霉變程度玉米樣品中的ZEN和AFB1含量，結(jié)果表明預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較高[97]。沈飛等[98]研究表明PLS-DA法可較好區(qū)分不同AFT含量的糙米，模型的留一交互驗(yàn)證正確率高于80%。電子鼻技術(shù)對(duì)大米樣品中的真菌及毒素也具有很好的檢測(cè)結(jié)果，PLSR分析顯示電子鼻響應(yīng)信號(hào)與糙米中AFB1的預(yù)測(cè)精度最高，相關(guān)系數(shù)r和RMSEP分別達(dá)到0.808和127.3 μg/kg。宋偉等[99]通過(guò)PCA很好地區(qū)分了不同儲(chǔ)藏條件的粳稻樣品，PLSR結(jié)果表明電子鼻信號(hào)對(duì)霉菌數(shù)量可以進(jìn)行定量預(yù)測(cè)，但存在準(zhǔn)確度不夠穩(wěn)定的問(wèn)題。沈飛等研究表明電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA和LDA可以成功區(qū)分大米[18]和花生[100]受霉菌侵染的不同程度，識(shí)別率可達(dá)到90.0%以上。PLSR模型對(duì)花生菌落總數(shù)預(yù)測(cè)的R2和RMSEP分別達(dá)到0.814 5和0.244 0 CFU/g。但是常用的金屬氧化物性半導(dǎo)體傳感器及其陣列具有所需工作溫度較高、長(zhǎng)時(shí)間工作后基準(zhǔn)值易發(fā)生漂移、對(duì)氣體混合物種的硫化物呈中毒反應(yīng)等缺點(diǎn)[101]。

4 結(jié) 語(yǔ)

無(wú)損檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，結(jié)合數(shù)據(jù)處理或圖像分析技術(shù)，其可以作為農(nóng)產(chǎn)品中真菌和真菌毒素污染的有效鑒別和檢測(cè)方法。其基本能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化操作，較省時(shí)簡(jiǎn)便，因此優(yōu)于傳統(tǒng)方法。目前紅外光譜檢測(cè)技術(shù)和HSI技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中真菌及毒素的檢測(cè)，并具有較高的精度，然而無(wú)損檢測(cè)技術(shù)還面臨著一些需要解決的問(wèn)題。

無(wú)損檢測(cè)技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用面臨的主要問(wèn)題是設(shè)備成本高、數(shù)據(jù)量大、圖像處理程序冗長(zhǎng)。此外，需要開(kāi)發(fā)并選擇有效且實(shí)用的分類算法。真菌及毒素檢測(cè)的未來(lái)趨勢(shì)是開(kāi)發(fā)高性能、低成本的無(wú)損檢測(cè)設(shè)備。結(jié)合不同無(wú)損技術(shù)，提供對(duì)所檢測(cè)樣品更加全面的信息。

無(wú)損檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于真菌及毒素的鑒別和定量，然而這些方法的檢測(cè)限尚未得到充分地研究和確定。真菌和毒素的無(wú)損檢測(cè)檢出限比較高，主要是樣品中毒素的含量較低且分布不均勻、背景成分的干擾、設(shè)備的定位精度以及環(huán)境因素（溫度、光等）等原因造成的[29]。

目前無(wú)損檢測(cè)技術(shù)通常應(yīng)用于玉米及小麥中真菌及毒素的檢測(cè)，且多針對(duì)有限的幾種真菌或毒素，在分離不同菌種時(shí)準(zhǔn)確率較低。未來(lái)無(wú)損檢測(cè)技術(shù)還需要進(jìn)行深入地研究，如在短時(shí)間內(nèi)對(duì)不同農(nóng)產(chǎn)品中的多種真菌或毒素進(jìn)行同時(shí)分析，利用更大的數(shù)據(jù)集和先進(jìn)的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件開(kāi)發(fā)更穩(wěn)健的校準(zhǔn)模型，以及提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性等，隨著設(shè)備及儀器價(jià)格的降低和新算法的發(fā)展，這些無(wú)損快速的檢測(cè)技術(shù)將對(duì)農(nóng)業(yè)真菌和真菌毒素污染檢測(cè)有更大的價(jià)值[3]。