一氧化氮處理對馬鈴薯采后塊莖愈傷的促進(jìn)及機(jī)制

韓占紅，王 斌，楊瑞瑞，楊 乾，李志程，Dov PRUSKY,2，畢 陽,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.以色列農(nóng)業(yè)研究組織沃卡尼中心采后與食品研究所，以色列 貝達(dá)甘 50250）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是重要的糧菜兼用作物，在保障食物安全與營養(yǎng)方面作用突出。然而，馬鈴薯塊莖在采收以及采后分級、包裝、運(yùn)輸和裝卸期間易受機(jī)械損傷[1]，表面形成的傷口不僅加速塊莖水分蒸騰，而且為多種采后病原菌的侵染提供了通道，導(dǎo)致塊莖貯藏期間的腐爛[2]。此外，真菌侵染還會在塊莖體內(nèi)積累真菌毒素，造成潛在的食用安全隱患[3]。雖然馬鈴薯塊莖表面的傷口具有自我愈合的能力，但自然愈傷所需時間較長[4]。因此，亟待開發(fā)促進(jìn)馬鈴薯塊莖采后愈傷的新措施。一些外源化學(xué)藥物可促進(jìn)馬鈴薯的塊莖愈傷。脫落酸可通過促進(jìn)馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝，提高抗氧化酶活性來加速塊莖的愈傷[5]。水楊酸及其結(jié)構(gòu)類似物苯并噻重氮也可通過激活苯丙烷代謝而促進(jìn)馬鈴薯塊莖的愈傷[6-7]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體內(nèi)重要的信號分子，在調(diào)節(jié)植物應(yīng)對外界生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)中發(fā)揮著積極的作用[8]。有研究表明，采用NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）處理番茄能提高番茄果實(shí)多種防御酶的活性，促進(jìn)活性氧的積累，增強(qiáng)果實(shí)對Botrytis cinere和Rhizopus stolonifer的抗性[9-10]。NO可提高甘薯根苯丙烷代謝活性，增加傷口處木質(zhì)化細(xì)胞層厚度，促進(jìn)塊根的愈傷[11]。此外，NO還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞壁胼胝質(zhì)的沉積，提高損傷相關(guān)防御基因的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)馬鈴薯葉片的愈傷[12]。雖然已有NO促進(jìn)甘薯塊根和馬鈴薯葉片愈傷的報道，但NO是否影響馬鈴薯塊莖的采后愈傷尚鮮見報道。本研究以‘隴薯7號’馬鈴薯塊莖為試材，采用SNP溶液浸泡處理人工模擬損傷塊莖，于常溫黑暗條件下進(jìn)行愈傷。評價處理對愈傷期間塊莖質(zhì)量損失率及病情指數(shù)的影響，觀察塊莖傷口部位軟木脂和木質(zhì)素的積累，分析傷口處組織苯丙烷代謝活性變化，以期為馬鈴薯塊莖的快速愈傷提供方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘隴薯7號’馬鈴薯于2018年11月采自甘肅省渭源縣會川鎮(zhèn)，選取大小均勻、無病蟲害和機(jī)械傷的塊莖裝入網(wǎng)眼袋中（25 kg/袋），第二天運(yùn)抵本實(shí)驗(yàn)室，在（4±2）℃冷庫中貯藏待用。

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）由本實(shí)驗(yàn)室保藏，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）上保存待用。

SNP（純度98.5%）、聚乙二醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；過氧化氫試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

7 4-S 不銹鋼雙面刀片 上海吉列有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡、BX51熒光顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；H-1850R高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；1510-04087酶標(biāo)儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DW-HL218超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 塊莖人工損傷及SNP處理

塊莖人工損傷參照J(rèn)iang Hong等[7]的方法。將塊莖從冷庫中取出后回溫24 h。先用自來水沖洗塊莖除去表面泥土，然后用體積分?jǐn)?shù)2% NaClO溶液浸泡3 min進(jìn)行表面消毒，自然晾干后用刮皮刀在塊莖表皮中部刮出直徑為3 cm的傷口，每個塊莖刮傷口3 處。

塊莖的SNP浸泡處理參照Yin Jianyun等[11]的方法并略作修改。將上述損傷塊莖浸入0.5 mmol/L的SNP溶液中10 min，以清水浸泡作為對照，取出自然晾干后，裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（30 cm×40 cm，厚度0.02 mm）中，置于常溫（20～25 ℃、相對濕度70%～80%）黑暗條件下進(jìn)行愈傷，在愈傷的第3、5、7、14、21天進(jìn)行愈傷效果評價的指標(biāo)測定。

1.3.2 孢子懸浮液的制備及損傷接種

孢子懸浮液的制備參照Yin Yan等[13]的方法并略作修改。取28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d的F. sulphureum一皿，加入5 mL無菌水，用滅菌涂布器輕輕刮下硫色鐮刀菌的孢子，經(jīng)4 層紗布過濾至50 mL三角瓶中，漩渦振蕩15 s，使孢子分散均勻。使用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，將孢子濃度最終稀釋至1×106spores/mL。

損傷接種參照姜紅等[14]的方法，分別在塊莖愈傷第0、3、5、7、14、21天時，將40 μL上述孢子懸浮液用涂布器均勻涂于傷口表面，稍作晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋中（5 個塊莖/袋），于室溫（22±2）℃、相對濕度85%～90%的黑暗條件下貯藏7 d。

1.3.3 愈傷效果評價

1.3.3.1 質(zhì)量損失率的測定

采用稱質(zhì)量法測定質(zhì)量損失率。每個處理用塊莖9 個，重復(fù)3 次。

1.3.3.2 病情指數(shù)的測定

發(fā)病級別分別定義為：0級，損傷表面不發(fā)病；1級，損傷表面0～25%發(fā)病；2級，損傷表面25%～50%發(fā)??；3級，損傷表面50%～75%發(fā)病；4級，損傷表面大于75%發(fā)病。每處理用塊莖20 個，重復(fù)3 次。病情指數(shù)按下式進(jìn)行計算。

1.3.3.3 塊莖愈傷過程中軟木脂及木質(zhì)素的沉積觀察

聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP）的沉積觀察參照Fugate等[15]的方法并稍作修改。用74-S不銹鋼雙面刀片垂直傷口表面切出厚度0.2～0.3 mm左右的薄片。按以下步驟完成切片染色：0.1%小檗堿染色45 min后，吸去染料，用蒸餾水和75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液各沖洗3 遍，再用95%乙醇溶液沖洗2 遍，脫去染料，然后在0.25%甲苯胺藍(lán)中放置1～2 min進(jìn)行復(fù)染，最后用蒸餾水和75%乙醇溶液洗去染料，SPP即染為紫藍(lán)色。將染色的切片置于載玻片上，蓋上蓋玻片并滴加蒸餾水在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

聚酯軟木脂（suberin polyaliphatic，SPA）的沉積觀察參照Lulai等[16]的方法并稍作修改。用不銹鋼雙面刀片垂直于塊莖愈傷表面切出0.2～0.3 mm厚的薄片，蒸餾水沖洗3 遍后，進(jìn)行染色觀察。初染：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%甲苯胺藍(lán)染液染色45 min，染色過程中輕輕上下?lián)u晃使其染色均勻；脫染料：分別用75%乙醇溶液沖洗3 次，再用蒸餾水沖洗3 次；復(fù)染：吸取1%中性紅染液，染色1.0～1.5 min；除去染料：先用蒸餾水沖洗，再用75%乙醇溶液沖洗，最后再用蒸餾水沖洗。將染好色的切片置于載玻片上，滴一滴蒸餾水后加蓋蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

木質(zhì)素的染色觀察參照Alba等[17]的方法并略作修改。將損傷塊莖用不銹鋼雙面刀片垂直于傷口表面切出厚度為0.2～0.3 mm的薄片，用蒸餾水浸泡沖洗數(shù)遍，以除去切片組織中的淀粉顆粒，隨后置于干凈的載玻片上，滴加1 g/100 mL的間苯三酚染色1.5 min后，再加1～2 滴濃鹽酸，木質(zhì)素即染為紅色，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

塊莖愈傷組織中的SPP、SPA和木質(zhì)素細(xì)胞層厚度參照van Oirschot等[18]的方法通過IS Capture圖像軟件進(jìn)行測量并計算。

1.3.4 生化指標(biāo)測定

參照J(rèn)iang Hong等[7]的方法。用不銹鋼刀片切取塊莖損傷部位及以下2～3 mm左右的愈傷組織，立即用液氮冷凍后用研樣機(jī)研磨成干粉裝入50 mL離心管中，于-80 ℃的超低溫冰箱中保存待測。

1.3.4.1 酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia-lyase，PAL）活力的測定參照Koukol等[19]的方法并略作修改。取冷凍干粉1.0 g，加入3 mL提前預(yù)冷的提取緩沖液（含40 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和5 mmol/L β-巰基乙醇），于4 ℃、8 000×g條件下離心30 min，上清液即為粗酶提取液。反應(yīng)體系：3 mL pH 8.8硼酸緩沖液（50 mmol/L）、0.5 mL L-苯丙氨酸（20 mmol/L）、0.5 mL粗酶提取液，測定反應(yīng)體系混合10 s后在290 nm波長處的吸光度（A0），將混合液于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h后，再次測定290 nm波長處的吸光度（A1）；空白對照以0.5 mL蒸餾水代替粗酶提取液，其余同反應(yīng)體系。以每小時每克鮮質(zhì)量果肉吸光度增加0.01為1 個PAL活力單位（U），PAL活力表示為U/g。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照J(rèn)iang Aili等[20]的方法。取冷凍干粉2 g，加入5 mL乙酸-乙酸鈉提取緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、4 g/100 mL PVP和體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100），于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液即為粗酶提取液。反應(yīng)體系：3.0 mL 25 mmol愈創(chuàng)木酚溶液、0.3 mL粗酶提取液，0.1 mL 0.5 mol/L H2O2溶液。反應(yīng)15 s時測定混合液在470 nm波長處的吸光度，測定持續(xù)2 min，以蒸餾水作為參比。以每克鮮質(zhì)量果肉每分鐘吸光度增加1為1 個POD活力單位（U），POD活力表示為U/g。

1.3.4.2 總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量測定

總酚含量的測定參照Scalbert等[21]的方法。取冷凍干粉1.0 g，加入5 mL含體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸和體積分?jǐn)?shù)70%丙酮的混合溶液進(jìn)行提取，之后將混合液置于4 ℃黑暗環(huán)境24 h，隨后8 000×g離心30 min，收集上清液用于總酚和類黃酮含量的測定。測定體系：1 mL提取液、稀釋10 倍的福林-酚試劑2 mL、2 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液，50 ℃放置5 min，以甲醇作對照，在760 nm波長處測定OD值，并以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算總酚含量，結(jié)果以每100 g鮮質(zhì)量果肉中所含沒食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

類黃酮含量的測定參照C e v k 等[22]的方法并略作修改。測定體系：0.5 m L 提取液、0.1 5 m L 10 g/100 mL AlCl3·6H2O溶液、0.15 mL 0.5 g/100 mL NaNO2溶液，常溫下靜置反應(yīng)5 min后，加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，在510 nm波長處測定OD值，并以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計算類黃酮含量。結(jié)果以每100 g鮮質(zhì)量果肉中所含的沒食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

木質(zhì)素含量的測定參照Hamerschmidt等[23]的方法。稱取冷凍干粉1.0 g，加入3 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，于4 ℃、8 000×g離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用95%乙醇溶液洗滌3 遍，用乙醇與正己烷體積比為1∶2的溶液沖洗3 遍，將清洗后的沉淀物在烘箱中干燥24 h，然后溶于1 mL體積分?jǐn)?shù)25%溴化乙酰冰醋酸溶液，在70 ℃下水浴30 min，隨后加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺，于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，取上清液0.5 mL并用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長處測定OD值，木質(zhì)素含量以每克鮮質(zhì)量果肉的OD280nm表示。

1.3.4.3 H2O2含量的測定

H2O2含量使用過氧化氫試劑盒進(jìn)行測定。稱取0.5 g的冷凍干粉，加入4.5 mL生理鹽水置于冰上進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液。按試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，混勻后，于405 nm波長處測定OD值。H2O2含量單位為mmol/g，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計。參照Brabford[24]的考馬斯亮藍(lán)染色法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

上述各項(xiàng)測定至少重復(fù)3 次。全部數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.0軟件作圖；用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO處理對愈傷期間塊莖質(zhì)量損失率和病情指數(shù)的影響

由圖1A可見，隨著愈傷時間延長，SNP處理組塊莖與對照組塊莖的質(zhì)量損失率均逐漸上升，且SNP處理組塊莖的質(zhì)量損失率顯著低于對照組，愈傷7 d時，SNP處理組塊莖質(zhì)量損失率較對照組低43.5%（P＜0.05）。由圖1B可見，隨著愈傷時間延長，SNP處理組與對照組損傷接種塊莖的病情指數(shù)逐漸降低，且SNP處理組塊莖的病情指數(shù)低于對照組，在愈傷7 d時，SNP處理組塊莖病情指數(shù)低于對照組27%（P＜0.05）。質(zhì)量損失率和病情指數(shù)的結(jié)果表明，NO處理促進(jìn)了馬鈴薯塊莖的愈傷。

圖1 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷期間質(zhì)量損失率（A）和病情指數(shù)（B）的影響Fig. 1 Effect of NO treatment on mass loss rate (A) and disease index (B)of potato tubers during wound healing

2.2 NO處理對馬鈴薯塊莖傷口處軟木脂和木質(zhì)素積累的影響

圖2 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處SPP（A）、SPA（B）和木質(zhì)素（C）積累的影響Fig. 2 Effect of NO treatment on the accumulation of SPP (A), SPA (B)and lignin (C) in wounds of potato tubers during healing

圖3 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處SPP（A）、SPA（B）和木質(zhì)素（C）細(xì)胞層厚度的影響Fig. 3 Effect of NO treatment on cell layers thickness of SPP (A),SPA (B) and lignin (C) in wounds of potato tubers during healing

愈傷期間，SNP處理組塊莖和對照組塊莖傷口處的SPP和SPA均逐漸積累，積累差異始于愈傷的第3天，其積累速率和積累量均明顯高于對照組（圖2A、B）。同樣，SPP和SPA細(xì)胞層厚度在愈傷期間逐漸增加，且SNP處理組顯著高于對照組。愈傷7 d時，SPP和SPA細(xì)胞層厚度分別高于對照組25.2%和27.3%（P＜0.05）（圖3A、B）。愈傷期間，木質(zhì)素的積累速率和積累量也逐漸增加，差異始于第5天，SNP處理組的積累速率和積累量均明顯高于對照組（圖2C）。處理組塊莖傷口處木質(zhì)素細(xì)胞層的厚度在愈傷期間也顯著高于對照組，愈傷7 d時高出對照組23.6%（P＜0.05）（圖3C）。上述結(jié)果表明，NO處理促進(jìn)了馬鈴薯塊莖傷口處軟木脂和木質(zhì)素的積累。

2.3 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷組織中PAL活力以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

圖4 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處PAL活力（A）以及總酚（B）、類黃酮（C）和木質(zhì)素（D）含量的影響Fig. 4 Effect of NO treatment on PAL activity (A), and the contents of total phenols (B), flavonoids (C) and lignin (D) in wounds of potato tubers during healing

隨愈傷時間延長，SNP處理組和對照組塊莖傷口處的PAL活力先升高后下降，愈傷時間為7 d時達(dá)到峰值，SNP處理組塊莖的PAL活力始終高于對照組，愈傷14 d時高出對照組75.3%（P＜0.05）（圖4A）。隨愈傷時間延長，SNP處理組與對照組塊莖傷口處的總酚和類黃酮的含量整體呈持續(xù)增加趨勢，除愈傷第3天外，其他愈傷時間的SNP處理組均顯著高于對照組。愈傷14 d時，SNP處理組塊莖的總酚和類黃酮含量分別高出對照31%和39.6%（P＜0.05）（圖4B、C）。隨愈傷時間延長，SNP處理組與對照組塊莖傷口處的木質(zhì)素含量不斷增加，SNP處理組的木質(zhì)素含量均顯著高于對照組，愈傷14 d時高出對照組32.8%（P＜0.05）（圖4D）。上述結(jié)果表明，NO處理激活了馬鈴薯塊莖傷口處組織的苯丙烷代謝。

2.4 NO處理對馬鈴薯塊莖愈傷組織中的H2O2含量和POD活力的影響

SNP處理組和對照組塊莖傷口處的H2O2含量隨愈傷時間的延長而逐漸升高，愈傷時間較短（0～5 d）時，對照組的H2O2含量高于SNP處理組，愈傷時間較長（7～21 d）時，SNP處理組的H2O2含量高于對照組，愈傷14 d時高出對照組34.6%（P＜0.05）（圖5A）。SNP處理組和對照組塊莖傷口處的POD活力隨愈傷時間延長不斷增加，且SNP處理組塊莖的POD活力始終高于對照組，愈傷14 d時高出對照組81.7%（P＜0.05）（圖5B）。

圖5 NO處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的影響Fig. 5 Effect of NO treatment on H2O2 content (A) and peroxidase activity (B)in wounds of potato tubers during healing

3 討 論

作為植物體內(nèi)重要的信號分子，NO在誘導(dǎo)植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[25]，其可與水楊酸、茉莉酸（jasmonic acid，SA）、乙烯、活性氧以及Ca2+通道等信號分子相互作用，協(xié)同調(diào)控植物的抗病防御反應(yīng)[26-27]。此外，NO還可激發(fā)苯丙烷代謝，從而誘導(dǎo)木質(zhì)素以及一系列植保素的合成[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，NO可激活馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝，提高POD活力和愈傷后期H2O2含量，促進(jìn)傷口處軟木脂和木質(zhì)素的積累，加速馬鈴薯塊莖的采后愈傷。由此表明，NO在促進(jìn)馬鈴薯塊莖的愈傷中發(fā)揮了積極作用。

苯丙烷代謝在馬鈴薯塊莖愈傷中具有重要的貢獻(xiàn)，可為SPP和木質(zhì)素提供聚合所需的酚類物質(zhì)單體[29]。PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，也是參與苯丙烷代謝第一步反應(yīng)的酶[30]，可催化L-苯丙氨酸脫去氨基生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶的作用下生成香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等酚酸，這些酚酸會被4-香豆酰-輔酶A（coenzyme A，CoA）-連接酶轉(zhuǎn)化成為相對應(yīng)的香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA，反應(yīng)生成的這些酚酸-CoA會在肉桂酰CoA還原酶和肉桂醇脫氫酶的催化下合成SPP所需的酚類物質(zhì)單體[31]。此外，肉桂醇脫氫酶還會將肉桂醛、咖啡醛和芥子醛轉(zhuǎn)化為p-肉桂醇、咖啡醇和芥子醇，作為合成木質(zhì)素的單體[32]。這些木質(zhì)素單體在POD的作用下聚合形成木質(zhì)素[33]?？偡印㈩慄S酮和木質(zhì)素是苯丙烷代謝的重要終產(chǎn)物。酚類化合物一方面作為合成木質(zhì)素的前體，參與了愈傷結(jié)構(gòu)的形成與傷口的修復(fù)；另一方面其本身具有抗病原菌的特性，可以抵抗真菌孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)及其菌絲生長[34]。類黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化和自由基清除能力，可有效抑制多種真菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長[35]。木質(zhì)素不僅作為植物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)性屏障抵抗病原物侵染，還可使真菌菌絲尖端木質(zhì)化[36]。已有研究表明，NO可有效誘導(dǎo)MdDHQS、MdSKDH、MdSK和MdEPSPS基因的表達(dá)，促進(jìn)莽草酸途徑中莽草酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的積累，從而為苯丙烷代謝途徑提供底物[37]。NO還可顯著誘導(dǎo)煙草和擬南芥葉片中SA的積累[38-39]。此外，NO處理還可顯著上調(diào)馬鈴薯葉片損傷相關(guān)基因PAL的轉(zhuǎn)錄水平[12]。由此表明，NO通過促進(jìn)SA積累激發(fā)了苯丙烷代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，NO處理提高了馬鈴薯塊莖傷口處的PAL活力，促進(jìn)了總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累。該結(jié)果與Yin Jianyun[11]等采用NO處理甘薯根和Ge Yonghong等[36]采用NO處理蘋果果實(shí)觀察到的結(jié)果類似。

H2O2在馬鈴薯塊莖愈傷組織的形成中具有信號分子和氧化交聯(lián)的雙重作用。H2O2既可作為信號分子激發(fā)愈傷早期的防衛(wèi)反應(yīng)[40]，如作為激活苯丙烷代謝的第二信使[41]，也可上調(diào)軟木脂形成過程中的相關(guān)基因表達(dá)和蛋白合成，參與酚單體與芳香結(jié)構(gòu)域的氧化交聯(lián)[42-43]。愈傷過程中所需的活性氧主要來源于質(zhì)膜NADPH氧化酶[44]。首先，NADPH氧化酶通過轉(zhuǎn)移NADPH電子到O2產(chǎn)生O2-·，由于O2-·存活壽命很短，其很快在超氧化物歧化酶的作用下歧化生成壽命較長的H2O2[45]。有研究表明，NO可提高超氧化物歧化酶活力來增加番茄[10]和藍(lán)莓[45]果實(shí)的H2O2水平。由此表明，NO在誘導(dǎo)H2O2的積累方面具有積極貢獻(xiàn)。POD作為軟木脂和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，在H2O2參與下通過氧化交聯(lián)參與了軟木脂和木質(zhì)素的聚合[46]。SPP主要由苯丙烷代謝產(chǎn)生的羥基肉桂酸及其衍生物阿魏酸等通過酯鍵和醚鍵連接形成[47]，主要阻止細(xì)菌對損傷塊莖的侵染。SPA主要由α,ω-二元酸、ω-羥基酸、長鏈脂肪酸、中長鏈脂肪酸以及小部分的烷烴和烷酸通過酯鍵相連聚合而成，這些單體主要通過脂肪酸代謝產(chǎn)生[48]，SPA主要對真菌性病害有抵抗作用。最終，SPP和SPA會進(jìn)一步在甘油的交聯(lián)作用下聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，沉積于細(xì)胞壁表面形成封閉層[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，NO處理后的塊莖具有較高的POD活力和在愈傷后期具有較高的H2O2含量，表明POD和H2O2積極參與了軟木脂和木質(zhì)素底物的氧化交聯(lián)。但至于POD如何氧化交聯(lián)軟木脂和木質(zhì)素單體尚有待進(jìn)一步的探討研究。

4 結(jié) 論

與對照組相比，NO處理可激活馬鈴薯塊莖傷口處的PAL活力，提高了總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量，NO處理還可增加POD活力和愈傷后期的H2O2含量，加速軟木脂和木質(zhì)素在傷口處的積累，從而降低了損傷塊莖的質(zhì)量損失率和病情指數(shù)，促進(jìn)了馬鈴薯塊莖的采后愈傷。