• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    樺木酸對環(huán)磷酰胺致小鼠肝臟損傷的保護作用

    2020-11-27 10:47:28馬朝陽朱利娟羅晨曦朱子寒高鑫禹馬玉容歐朝萍易金娥
    食品科學(xué) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:預(yù)處理氧化應(yīng)激細胞因子

    馬朝陽,朱利娟,羅晨曦,朱子寒,孔 麗,林 星,高鑫禹,馬玉容,歐朝萍,易金娥,2,3,*

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.畜禽保健湖南省工程研究中心,湖南 長沙 410128;3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長沙 410128)

    環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CYP)屬于氮芥類烷化劑抗腫瘤藥,在臨床上使用超過40 年,主要用于癌癥、免疫缺陷類疾病的治療[1-2],因其對組織缺乏特異選擇性,過量使用會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損,出現(xiàn)免疫缺陷[3],并且還可能導(dǎo)致骨髓抑制、氧化應(yīng)激和其他副作用,甚至威脅生命[4]。CYP通過促進干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌,降低白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的分泌,破壞細胞免疫,抑制自然殺傷細胞和巨噬細胞,最終抑制機體的免疫功能[5]。潘航等[6]研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射CYP能夠降低胸腺、脾臟和血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,提高胸腺和脾臟中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在臨床研究中,CYP常被用于免疫抑制模型和氧化應(yīng)激模型的建立。

    樺木酸(betulinic acid,BA)屬于羽扇豆烷型五環(huán)三萜類物質(zhì)[7],具有多種藥理作用,如抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗菌[8]。BA廣泛分布于樺木屬植物和其他多種植物中,如酸棗仁、槐花、天門冬、睡菜葉等[9]。前期研究發(fā)現(xiàn),BA具有免疫調(diào)節(jié)的作用,能夠增強小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫[10-12]。BA對地塞米松致小鼠氧化應(yīng)激或?qū)凭愿螕p傷具有保護作用[13-16],并且,BA對CYP引起的小鼠免疫器官氧化應(yīng)激有預(yù)防性保護作用[17]。然而BA是否對CYP引起的肝臟損傷具有改善和預(yù)防性保護作用還鮮見報道。因此,本實驗采用腹腔注射CYP誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型,從肝功能相關(guān)指標(biāo)、抗氧化能力以及抗炎作用來研究BA對其預(yù)防性保護作用,旨在為BA的臨床應(yīng)用及作為藥食同源物的應(yīng)用提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    50 只健康雄性昆明小鼠,4~5 周齡,無特定病原體(SPF)級,體質(zhì)量為(15±2)g,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2009-0004。飼料為大小鼠維持飼料,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,其主要原料為玉米、小麥、豆粕、魚粉、啤酒酵母粉、苜蓿草粉、麥麩等;主要營養(yǎng)成分(以干質(zhì)量計):粗蛋白(≥18%,質(zhì)量分數(shù),下同)、粗脂肪(≥4%)、粗纖維(≤5%)、鈣(1.0%~1.8%)、磷(0.6%~1.2%)、賴氨酸(≥0.82%)、蛋氨酸+胱氨酸(≥0.53%)。

    BA、CYP 美國Sigma公司;TRIzol提取試劑盒美國L i f e 公司;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(r e v e r s e transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒、SYBR Green熒光染料 日本Takara公司;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)引物上海生工生物工程股份有限公司;SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JXFSTPRP-24組織勻漿機 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;5404EQ220531高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;AY220電子分析天平 日本島津有限公司;BS-200自動生化分析儀 深圳邁瑞公司;Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司;788BR03720 qPCR儀美國Bio-Rad公司;EM UC7超薄切片機 德國Leica公司;ECLIPSE C1正置顯微鏡 日本尼康公司。

    1.3 方法

    1.3.1 小鼠分組及喂養(yǎng)

    根據(jù)前期研究,確定了BA和CYP的給藥時間和劑量[16,18]。將小鼠放置在環(huán)境溫度為22~25 ℃,相對濕度為40%~70%,氨濃度不超過14 mg/m3的飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)1 周后,隨機分為5 組,即空白組、CYP組以及BA低、中、高劑量(0.25、0.50、1.00 mg/kgmbBA+CYP)組,每組10 只。將不同劑量的BA混懸于質(zhì)量分數(shù)1%的可溶性淀粉糊,按0.01 mL/gmb灌胃,空白組和CYP組給予1%可溶性淀粉糊,每天9∶00給藥一次,連續(xù)給藥14 d。第15和第16天,CYP組,BA低、中、高劑量組腹腔注射50 mg/kgmbCYP誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型,空白組注射等量的生理鹽水。禁食16 h(自由飲水)后,眼眶采血,頸椎脫臼處死。血液在室溫靜置2 h,3 000 r/min離心10 min,收集血清用于檢測生化指標(biāo)。無菌條件下摘取肝臟(稱質(zhì)量),按下式計算肝臟指數(shù)。

    一部分肝臟用預(yù)冷生理鹽水按1∶9(m/V)配制成10%組織勻漿液,3 000 r/min離心15 min,收集上清液于用于檢測SOD、CAT、GSH-Px活力以及GSH和MDA含量。另一部分肝臟儲存于-80 ℃用于細胞因子mRNA的相對表達量檢測。

    1.3.2 血清指標(biāo)檢測

    用BS-200全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST的活力。

    1.3.3 肝臟抗氧化能力指標(biāo)檢測

    SOD活力采用羥胺法測定;GSH-Px活力和GSH含量均采用二硫代二硝基苯甲酸法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定;CAT活力采用鉬酸銨比色法測定。SOD、CAT、GSH-Px、MDA和GSH水平的檢測均按試劑盒說明書嚴格操作。

    1.3.4 qPCR檢測肝臟炎性因子相關(guān)基因的表達量

    1.3.4.1 引物的設(shè)計

    按照qPCR引物設(shè)計要求來設(shè)計引物,引物見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

    1.3.4.2 表達量的測定

    取0.06 g肝組織進行勻漿,使用TRIzol法提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR儀反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR Green I試劑盒和qPCR儀對目的基因相對表達量進行測定。目的基因的表達以β-actin作為內(nèi)參進行矯正,保存數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析進行差異顯著性比較,兩兩比較采用q檢驗,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BA對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

    由圖1 可見,各組小鼠初始體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05);實驗結(jié)束后,與空白組相比,CYP組小鼠體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05),肝臟指數(shù)增加,但差異不顯著(P>0.05);與CYP組相比,BA預(yù)處理使小鼠體質(zhì)量增加,以0.50 mg/kgmbBA差異顯著(P<0.05),同時使肝臟指數(shù)降低,以0.50 mg/kgmb和1.00 mg/kgmbBA差異顯著(P<0.05)。

    圖1 BA對CYP致小鼠初始(A)、終末(B)體質(zhì)量和肝臟指數(shù)(C)的影響Fig. 1 Effect of BA on initial body mass (A), final body mass (B) and liver index (C) of mice with CYP-induced liver injury

    2.2 BA對CYP致小鼠血清酶活力的影響

    圖2 BA對CYP致小鼠血清AST(A)和ALT(B)活力的影響Fig. 2 Effect of BA on the activities of AST (A) and ALT (B) in serum of mice with CYP-induced liver injury

    由圖2可見,與空白組相比,CYP組小鼠血清中AST和ALT的活力極顯著升高(P<0.01);與CYP組相比,BA呈劑量依賴性降低AST的活力,其中以1.00 mg/kg mbBA組差異顯著(P<0.05);同時,BA降低血清中ALT活力,以0.50 mg/kg mbBA組差異顯著(P<0.05)。

    2.3 BA對CYP致小鼠肝組織病理變化的影響

    圖3 蘇木精-伊紅染色觀察BA對CYP致小鼠肝組織病理變化的影響(20×)Fig. 3 Effect of BA on pathological changes of liver tissues from CYP-induced mice (20 ×)

    由圖3可見,空白組肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝竇結(jié)構(gòu)整齊;CYP組肝小葉界限模糊,細胞核周圍出現(xiàn)大量空泡;BA預(yù)處理后,由CYP引起的肝細胞空泡樣變性緩解,以0.50 mg/kg mbBA組改善作用最為明顯。

    2.4 BA對CYP致小鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響

    圖4 BA對CYP致小鼠肝臟SOD(A)、GSH-Px(B)、CAT(C)活力和GSH(D)、MDA(E)含量的影響Fig. 4 Effect of BA on the levels of SOD (A), GSH-Px (B), CAT (C) and GSH (D), and MDA (E) in liver tissues of CYP-treated mice

    由圖4可見,與空白組對比,CYP組的SOD活力和GSH含量顯著上升(P<0.05),GSH-Px活力和MDA含量升高,CAT活力下降,但差異不顯著(P>0.05);與CYP組對比,BA預(yù)處理導(dǎo)致SOD的活力下降,以0.25 mg/kg mbBA組差異顯著(P<0.05);GSH含量變化無顯著性差異(P>0.05);BA預(yù)處理對肝臟GSH-Px和CAT活力無顯著差異(P>0.05);各BA組的MDA含量均呈下降趨勢,差異不顯著(P>0.05)。

    2.5 BA對CYP致小鼠肝臟細胞因子的影響

    由圖5 可見,與空白組相比,C Y P 組的I L-1 β和TNF-α mRNA表達量極顯著升高(P<0.01),IL-6 mRNA表達量極顯著降低(P<0.01),IL-10 mRNA表達量略微降低(P>0.05)。與CYP組相比0.25 mg/kg mb和1.00 mg/kg mbBA預(yù)處理后,IL-1β mRNA的表達量顯著降低(P<0.05,P<0.01),但0.50 mg/kg mbBA使IL-1β表達量升高,但差異不顯著(P>0.05);BA預(yù)處理使IL-6表達量呈劑量依賴式上升(P<0.01);0.50 mg/kg mb和1.00 mg/kg mbBA使TNF-α的表達量極顯著下降(P<0.01),但0.25 mg/kg mbBA預(yù)處理使肝臟TNF-α的表達量極顯著上升(P<0.01);BA預(yù)處理均能提高IL-10 mRNA的相對表達量,以0.50 mg/kg mbBA組差異極顯著(P<0.01)。

    圖5 BA對CYP致小鼠肝臟IL-1β(A)、IL-6(B)、IL-10(C)和TNF-α(D) mRNA表達的影響Fig. 5 Effect of BA on the mRNA expression of IL-1β (A), IL-6 (B),IL-10 (C) and TNF-α (D) in liver tissues of CYP-induced mice

    3 討 論

    CYP作為氮芥類烷化劑,其抗癌譜廣,廣泛用于治療各種癌癥,因其胃腸道和肝臟等毒性作用臨床應(yīng)用受到限制。高劑量CYP可引起急性肝毒性效應(yīng),其特征是通過肝臟產(chǎn)生炎性細胞因子和自由基來誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和氧化應(yīng)激。CYP可誘導(dǎo)肝細胞抗氧化能力下降,引起脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致肝細胞受損,表現(xiàn)為肝功能指標(biāo)ALT、AST和膽紅素的增加以及血清白蛋白濃度的降低等[19],血清酶活力急劇升高表明肝臟中的細胞損傷和細胞膜功能完整性的喪失。本實驗結(jié)果顯示,CYP引起了肝臟中AST和ALT水平的上升,并且從病理切片中可以看出CYP引起肝細胞出現(xiàn)大量空泡,說明CYP造成了肝損傷,破壞肝細胞細胞膜的完整性;而用BA預(yù)處理后,能夠下調(diào)由CYP引起的小鼠肝指數(shù)的上升以及血清酶活力的升高,說明BA通過具有潛在的修復(fù)細胞膜的穩(wěn)定性,改善肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),從而緩解CYP引起的肝臟損傷。

    CYP在肝臟中經(jīng)細胞色素P450氧化酶參與生物轉(zhuǎn)化,形成具有高度毒性的代謝物——丙烯醛和磷酰胺,丙烯醛與GSH結(jié)合,干擾組織抗氧化防御系統(tǒng),并誘導(dǎo)活性氧的過量生成,活性氧攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),產(chǎn)生MDA等物質(zhì)[20]。本實驗中,CYP組肝臟MDA含量升高,與Mahmoud等[21]的結(jié)果相似,說明CYP誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟的氧化損傷;用BA預(yù)處理后MDA含量下降,說明BA通過減少脂質(zhì)過氧化,緩解機體的氧化損傷。CAT、SOD、GSH和GSH-Px作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,通過與其他酶協(xié)同完成細胞內(nèi)的抗氧化作用。CAT主要存在于組織細胞的微粒體內(nèi),清除體內(nèi)的羥自由基,催化H2O2的分解;SOD清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受氧化損傷;而GSH-Px則主要通過催化GSH的活力,還原狀態(tài)的GSH直接與活性氧自由基結(jié)合反應(yīng),從而清除體內(nèi)的氧自由基,保護細胞免受有毒物質(zhì)及氧化物的攻擊[22]。Alqahtani等[19]研究發(fā)現(xiàn),CYP引起小鼠肝臟CAT、SOD和GSH-Px的活力及GSH含量降低,誘導(dǎo)氧化損傷。本研究結(jié)果顯示,CYP組CAT活力降低,說明CYP引起肝臟氧化應(yīng)激;但SOD、GSH和GSH-Px水平升高,可能是CYP誘導(dǎo)的急性損傷引起的機體代償性反應(yīng),刺激了SOD、GSH和GSH-Px的過度分泌,維持了機體氧化系統(tǒng)的平衡。據(jù)研究報道,頭頸部癌癥患者組織中GSH含量升高,但血液中GSH含量降低[23]。乳腺癌患者血液和組織中GSH含量隨著疾病的發(fā)展而降低[24]?;诖?,認為氧化應(yīng)激引起初期組織損傷,GSH被谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶快速降解,以抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷,機體捕獲到相關(guān)信號后,誘導(dǎo)組織中GSH快速合成和釋放,來適應(yīng)環(huán)境的變化;隨著疾病的發(fā)展和組織的進一步損傷,GSH的消耗率高于合成率。因此,在氧化應(yīng)激引起組織損傷的早期,損傷組織中GSH的水平高于正常組織[25]。BA預(yù)處理后,肝組織中CAT的活力以及0.25、1.00 mg/kg mbBA組GSH含量繼續(xù)升高,說明BA通過增強抗氧化酶的活力,對CYP致肝臟氧化損傷起到預(yù)防性保護作用。但是BA預(yù)處理后,SOD活力出現(xiàn)下降趨勢,說明BA通過恢復(fù)SOD活力和GSH的水平,改變氧化狀態(tài),維持氧化還原系統(tǒng)的穩(wěn)定。有趣的是0.50 mg/kg mbBA組GSH水平出現(xiàn)下降趨勢,這可能是因為藥物在體內(nèi)的效果是呈現(xiàn)U形趨勢,即在一定的濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的升高,藥效也升高,當(dāng)達到最高藥效時,繼續(xù)增加藥物的濃度會引起相反的結(jié)果,也就是說藥物是有合適的濃度范圍,過高或者過低可能會導(dǎo)致不良的結(jié)果[26]。因此,在本研究中,0.50 mg/kg mb的BA緩解了由CYP引起的GSH水平的上升。以上結(jié)果說明BA通過清除自由基和抗氧化特性對CYP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和肝臟損傷起保護作用。

    氧化應(yīng)激參與多種生理過程,尤其是在炎癥應(yīng)答中發(fā)揮類似“第二信使”的作用。越來越多的研究表明,炎性細胞因子是炎癥反應(yīng)的生理信使分子[27]。炎癥包括炎癥細胞的激活,促炎因子的分泌,以及不同炎癥介質(zhì)的釋放,其中IL-1β、IL-6和TNF-α作為促炎因子,是研究炎癥反應(yīng)的重要細胞因子。已有研究證明,CYP誘導(dǎo)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌,抑制抗炎因子IL-10水平升高,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[28-29];研究發(fā)現(xiàn),小鼠腹腔注射CYP,刺激肝臟IL-1β和TNF-α mRNA表達增加,抑制IL-10 mRNA表達,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。BA預(yù)處理緩解了CYP致肝臟IL-1β、TNF-α mRNA表達升高,降低IL-10 mRNA表達,Ajala-Lawal[30]和Li Nan[31]等研究發(fā)現(xiàn),BA引起血液中IL-1β和成纖維滑膜細胞TNF-α mRNA的表達量下降;BA可恢復(fù)IL-10的表達量對腎臟起到預(yù)保護作用[32],這說明BA通過抑制促炎因子的分泌,促進抗炎因子的分泌,對CYP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到預(yù)防性保護作用。雖然大量的動物實驗顯示CYP具有促炎效果[33-35],但有研究發(fā)現(xiàn),CYP能抑制TNF-α和IL-12的分泌或者對IL-6、IL-10、TNF-α分泌沒有影響[36-37],還有研究發(fā)現(xiàn),CYP既能促進又能降低機體IL-6、IL-10、IFN-g和IL-1β水平[38-39]。CYP這種矛盾的現(xiàn)象可能是由于其對細胞因子產(chǎn)生的影響主要依賴于產(chǎn)生細胞因子和刺激的細胞,也有可能是幾條通路共同參與了這一過程。本實驗中,CYP使小鼠肝臟IL-6 mRNA表達水平顯著降低,這可能是抑制促炎反應(yīng)的對抗機制的一部分,CYP的促炎反應(yīng)最終會引起代償性抗炎反應(yīng)。在BA預(yù)處理后緩解CYP致肝臟IL-6表達水平下降,此結(jié)果與Wang Xihong[25]報道一致。據(jù)研究報道,IL-6在大腦損傷后8~18 h內(nèi)達到最高水平,而TNF-α在3~8 h達到最高水平,說明在代償性反應(yīng)中,細胞因子的改變與時間呈現(xiàn)一定的關(guān)系[40],出現(xiàn)IL-6、IL-1β和TNF-α表達量不同步情況。所以,在本研究BA引起IL-6 mRNA的表達呈相反趨勢,并且不同劑量的BA對IL-1β和TNF-α mRNA表達水平的影響不同。綜上所述說明BA能調(diào)控炎性因子的平衡對肝臟炎癥損傷起到預(yù)防性保護作用。

    猜你喜歡
    預(yù)處理氧化應(yīng)激細胞因子
    抗GD2抗體聯(lián)合細胞因子在高危NB治療中的研究進展
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    基于預(yù)處理MUSIC算法的分布式陣列DOA估計
    淺談PLC在預(yù)處理生產(chǎn)線自動化改造中的應(yīng)用
    急性心肌梗死病人細胞因子表達及臨床意義
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    絡(luò)合萃取法預(yù)處理H酸廢水
    細胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過程中的作用
    基于自適應(yīng)預(yù)處理的改進CPF-GMRES算法
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    看免费av毛片| 久久久精品区二区三区| 黄色成人免费大全| 免费看a级黄色片| 精品一区二区三卡| 一区二区日韩欧美中文字幕| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一区二区三区精品91| 午夜老司机福利片| 少妇的丰满在线观看| 伦理电影免费视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 12—13女人毛片做爰片一| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久久久国产电影| 成人国产一区最新在线观看| 精品一区二区三卡| 另类亚洲欧美激情| 午夜福利,免费看| 男女之事视频高清在线观看| a级毛片在线看网站| 最近最新免费中文字幕在线| 一级,二级,三级黄色视频| 大陆偷拍与自拍| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av第一区精品v没综合| 99riav亚洲国产免费| 久久狼人影院| 久久久欧美国产精品| 久久久精品区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 免费观看人在逋| 波多野结衣av一区二区av| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产日韩欧美亚洲二区| 成年动漫av网址| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 757午夜福利合集在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本wwww免费看| 99精品在免费线老司机午夜| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女福利国产在线| 在线观看一区二区三区激情| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品人人爽人人爽视色| 精品国产一区二区久久| 丰满少妇做爰视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 丝袜美腿诱惑在线| 一级片'在线观看视频| 色老头精品视频在线观看| 午夜福利欧美成人| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久国内视频| 久久国产精品影院| 悠悠久久av| 久久久久久久国产电影| 日本五十路高清| 人妻 亚洲 视频| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久9热在线精品视频| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品在线美女| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 天天添夜夜摸| 狂野欧美激情性xxxx| 五月天丁香电影| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久九九热精品免费| 精品少妇久久久久久888优播| 飞空精品影院首页| 免费观看人在逋| 大码成人一级视频| 在线观看66精品国产| 久久中文看片网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 日韩免费av在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 91国产中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 女人精品久久久久毛片| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一区二区av电影网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美黑人精品巨大| av福利片在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 色尼玛亚洲综合影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 深夜精品福利| 亚洲一区二区三区欧美精品| 十分钟在线观看高清视频www| 丁香六月欧美| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品自拍成人| 亚洲avbb在线观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美 日韩 精品 国产| 高清视频免费观看一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美乱码精品一区二区三区| videos熟女内射| 久久久国产精品麻豆| 91av网站免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品视频人人做人人爽| 欧美在线一区亚洲| 大码成人一级视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 老熟女久久久| 97在线人人人人妻| 日本黄色日本黄色录像| 丝袜人妻中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 日日夜夜操网爽| 精品国产国语对白av| 色老头精品视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 丁香欧美五月| 国产三级黄色录像| 桃红色精品国产亚洲av| 成年女人毛片免费观看观看9 | 黄色视频,在线免费观看| 国产麻豆69| www日本在线高清视频| 欧美黑人精品巨大| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美午夜高清在线| 国产区一区二久久| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品一二三| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲,欧美精品.| 99久久国产精品久久久| 女性被躁到高潮视频| 国产一卡二卡三卡精品| 十分钟在线观看高清视频www| 精品福利观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲七黄色美女视频| 久久人妻av系列| 亚洲 国产 在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日本五十路高清| 国产精品 国内视频| 看免费av毛片| 考比视频在线观看| 视频区图区小说| 热99国产精品久久久久久7| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看www视频免费| 午夜福利在线免费观看网站| svipshipincom国产片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美黑人精品巨大| 人人妻人人澡人人看| 免费日韩欧美在线观看| 深夜精品福利| 美女扒开内裤让男人捅视频| www.自偷自拍.com| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 咕卡用的链子| 久久久久精品人妻al黑| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲中文av在线| 亚洲熟女精品中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 国产色视频综合| 99久久国产精品久久久| 精品国内亚洲2022精品成人 | 操美女的视频在线观看| 亚洲成人手机| 国产男靠女视频免费网站| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲人成电影观看| 91大片在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品自拍成人| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产av一区二区精品久久| 99香蕉大伊视频| 岛国在线观看网站| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 操出白浆在线播放| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久国产精品大桥未久av| 一级毛片电影观看| 亚洲成人免费av在线播放| 久久精品亚洲av国产电影网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色视频不卡| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产在线观看jvid| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费高清在线观看日韩| 黄色a级毛片大全视频| 欧美在线黄色| 亚洲成a人片在线一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| av天堂久久9| 久久久国产欧美日韩av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 手机成人av网站| 美女高潮到喷水免费观看| 免费av中文字幕在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 岛国在线观看网站| 免费观看人在逋| 一级毛片女人18水好多| 成年动漫av网址| 日本wwww免费看| 亚洲三区欧美一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 丁香六月欧美| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 婷婷丁香在线五月| 亚洲美女黄片视频| 精品国产一区二区久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 中文欧美无线码| 久久久久网色| 一夜夜www| 真人做人爱边吃奶动态| www.999成人在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品国产一区二区久久| 老汉色∧v一级毛片| 91成年电影在线观看| 桃花免费在线播放| 美女福利国产在线| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品在线美女| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人影院久久| 丝袜美足系列| 乱人伦中国视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 三级毛片av免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲精品一二三| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 高清欧美精品videossex| 大型黄色视频在线免费观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 国产日韩欧美视频二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 夫妻午夜视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 99久久人妻综合| 电影成人av| 中文字幕高清在线视频| 久久久久久人人人人人| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜成年电影在线免费观看| 在线观看www视频免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费观看av网站的网址| 女人精品久久久久毛片| 色老头精品视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆国产av国片精品| 黑人操中国人逼视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 宅男免费午夜| 欧美精品av麻豆av| 久久久欧美国产精品| 人妻久久中文字幕网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 99热网站在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产精品 国内视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久青草综合色| 午夜福利,免费看| 国产片内射在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 丝瓜视频免费看黄片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜两性在线视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一区二区三区激情视频| 国产精品成人在线| 超碰97精品在线观看| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 交换朋友夫妻互换小说| 水蜜桃什么品种好| 男女边摸边吃奶| 成年人午夜在线观看视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 9191精品国产免费久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 人妻久久中文字幕网| 日日爽夜夜爽网站| 女人精品久久久久毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品国产av在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 大码成人一级视频| 国产精品免费视频内射| 国产精品二区激情视频| a在线观看视频网站| 99精品在免费线老司机午夜| 丝袜在线中文字幕| 久久精品91无色码中文字幕| av国产精品久久久久影院| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区三区精品91| 久久国产亚洲av麻豆专区| 啦啦啦免费观看视频1| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 中国美女看黄片| 亚洲中文日韩欧美视频| avwww免费| 青草久久国产| 咕卡用的链子| av线在线观看网站| 国产xxxxx性猛交| tocl精华| 一区二区三区乱码不卡18| 12—13女人毛片做爰片一| 俄罗斯特黄特色一大片| 多毛熟女@视频| 男人舔女人的私密视频| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久av美女十八| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 在线 av 中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 香蕉丝袜av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利,免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产深夜福利视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 妹子高潮喷水视频| 99热国产这里只有精品6| 好男人电影高清在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产a三级三级三级| 日本vs欧美在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩视频在线欧美| svipshipincom国产片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久人妻av系列| 亚洲久久久国产精品| 脱女人内裤的视频| 日韩视频一区二区在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 手机成人av网站| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧美激情在线| 成年人黄色毛片网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲国产av影院在线观看| 97在线人人人人妻| 一级片'在线观看视频| 精品人妻在线不人妻| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| a级片在线免费高清观看视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品.久久久| 99九九在线精品视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产av新网站| 亚洲第一av免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 国产精品.久久久| 精品久久久精品久久久| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产成人影院久久av| 精品国产亚洲在线| 无人区码免费观看不卡 | svipshipincom国产片| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久中文字幕一级| 岛国在线观看网站| 亚洲五月婷婷丁香| www.自偷自拍.com| 婷婷丁香在线五月| 日韩视频一区二区在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜两性在线视频| 国产成人av教育| 少妇精品久久久久久久| 欧美黄色淫秽网站| 嫩草影视91久久| 日本av免费视频播放| 亚洲天堂av无毛| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲人成77777在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 国产精品.久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 1024视频免费在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 青青草视频在线视频观看| 久久久久精品人妻al黑| 我的亚洲天堂| 18禁国产床啪视频网站| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 久久久久精品人妻al黑| 日本av手机在线免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜福利欧美成人| 色综合欧美亚洲国产小说| 一个人免费看片子| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲成人免费电影在线观看| 超色免费av| 欧美乱码精品一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 人妻 亚洲 视频| 大片电影免费在线观看免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品国产乱码久久久久久小说| 999久久久精品免费观看国产| 中国美女看黄片| 欧美性长视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产亚洲精品一区二区www | 69av精品久久久久久 | 久久中文字幕一级| 中文字幕高清在线视频| 国产在线视频一区二区| 一级毛片女人18水好多| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 黄色a级毛片大全视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品乱久久久久久| 免费少妇av软件| 热99re8久久精品国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美乱妇无乱码| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| 精品国产国语对白av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 后天国语完整版免费观看| 美女视频免费永久观看网站| cao死你这个sao货| 99国产精品一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一夜夜www| 色老头精品视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 午夜激情av网站| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99精品在免费线老司机午夜| 1024香蕉在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品视频人人做人人爽| 精品国产乱码久久久久久小说| 91字幕亚洲| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品国产亚洲在线| 麻豆国产av国片精品| 丝袜在线中文字幕| 亚洲黑人精品在线| 国产精品电影一区二区三区 | 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产国语对白av| 老司机影院毛片| 中文字幕高清在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 两性夫妻黄色片| 12—13女人毛片做爰片一| 中国美女看黄片| 国产成人欧美| 免费观看a级毛片全部| 成年版毛片免费区| 一级,二级,三级黄色视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产区一区二久久| 国产又爽黄色视频| 欧美中文综合在线视频| 国产一卡二卡三卡精品| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人av激情在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 天天添夜夜摸| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲九九香蕉| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩欧美免费精品| a级毛片黄视频| 亚洲精华国产精华精| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 制服诱惑二区| 亚洲欧美激情在线| 国产国语露脸激情在线看| 97在线人人人人妻| 2018国产大陆天天弄谢| 久久av网站| 国产av国产精品国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 91九色精品人成在线观看| 满18在线观看网站| 一级黄色大片毛片| 在线观看免费日韩欧美大片| 18禁观看日本| 欧美黄色淫秽网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产精品电影一区二区三区 | 中亚洲国语对白在线视频| av免费在线观看网站| 欧美日韩成人在线一区二区| www.自偷自拍.com| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费在线观看完整版高清| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 18禁美女被吸乳视频| av免费在线观看网站| av福利片在线| 少妇精品久久久久久久| 国产片内射在线| 女性生殖器流出的白浆| 女性被躁到高潮视频| 久久性视频一级片| 老熟女久久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 十八禁网站免费在线| 9191精品国产免费久久| 欧美在线一区亚洲| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 老熟女久久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 黄色丝袜av网址大全| 成年人免费黄色播放视频| 午夜91福利影院| av网站免费在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频|