香菇多糖中單糖組成分析技術(shù)的研究進(jìn)展

邱雯曦，周禮仕，鐘輝云，王愛(ài)萍

(1.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，四川 自貢 643000；2.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，四川 自貢 643000)

香菇多糖是從香菇中提取出的一種重要生物活性成分，有多種藥理活性，如：抗病毒[1]、抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4]、抗輻射[5]、降血糖[6]等，其藥用價(jià)值甚高。香菇多糖是由不同單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的雜多糖，屬于高分子多聚物。1969年，香菇多糖第一次被發(fā)現(xiàn)并提取[7]，后被證明有抗腫瘤作用[8]，而引起了廣泛研究工作者的關(guān)注。研究藥物的構(gòu)效關(guān)系具有重要意義，香菇多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性有著密切關(guān)系。對(duì)于香菇多糖結(jié)構(gòu)的研究，單糖組成是最基本的研究對(duì)象。隨著人們對(duì)香菇多糖類(lèi)藥品、食品和保健品的開(kāi)發(fā)，質(zhì)量控制的系統(tǒng)化研究迫在眉睫。多糖的單糖組成指紋圖譜可為香菇多糖類(lèi)藥品保健品的質(zhì)量控制提供重要參考。因此，單糖組成的分析研究尤為重要。

香菇多糖的單糖組成分析包括幾個(gè)步驟：將多糖水解為單糖、對(duì)單糖進(jìn)行化學(xué)衍生、分離單糖組分、對(duì)分離后的單糖進(jìn)行檢測(cè)分析。本文將從以上幾個(gè)方面，對(duì)香菇多糖單糖組成分析取得的進(jìn)展及遇到的問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 降解香菇多糖為單糖方法的選取

降解多糖的方法較多，主要有超聲波降解法、電磁輻射降解法、高碘酸氧化、酶水解、酸堿水解法等。

1.1 超聲波法

超聲降解多糖分子屬于一種物理降解法。主要以自由基理論及機(jī)械剪切作用來(lái)解釋超聲波降解多糖分子的機(jī)理[9]。雖然此降解法操作性強(qiáng)具有綠色環(huán)保對(duì)外界污染小等優(yōu)點(diǎn)，但難以將多糖分子徹底分解為單糖且影響因素較多[9-10]。因此，超聲波降解法不適合用于多糖水解產(chǎn)物單糖組成的分析。

1.2 酶解法

糖苷酶是目前降解多糖最常用的一類(lèi)酶，通過(guò)降低多糖降解反應(yīng)活化能，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。糖苷酶分為外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶兩類(lèi)。酶法降解多糖條件溫和，反應(yīng)時(shí)間短且反應(yīng)效率高。β1,3-葡聚糖酶成功用于裂褶多糖的降解，凝膠滲透色譜法有效的監(jiān)控了裂褶多糖降解反應(yīng)程度[11]。酶催化降解多糖反應(yīng)現(xiàn)在還存在許多不足：酶只能專(zhuān)一性的催化某一類(lèi)底物；其次多數(shù)糖苷酶來(lái)源于生物體，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；酶需要固定載體上進(jìn)行催化，若不將酶固定，則催化反應(yīng)后需將其去除。但隨著研究的深入，酶解法有希望成為降解多糖的常用方法。

1.3 酸堿水解法

酸水解屬于化學(xué)方法，是分析多糖單糖組成目前最常用的降解多糖的方法。酸性溶液中有大量氫離子(H+)，利于將糖苷鍵中氧原子(O)進(jìn)行質(zhì)子化，從而打開(kāi)糖苷鍵，苷元脫離，碳正離子溶劑化，最終質(zhì)子脫去后產(chǎn)生單糖[12]。酸水解多糖比堿水解速率快，且單糖產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不易變化。早期的酸水解劑多使用鹽酸和硫酸混合酸，不僅操作麻煩且檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[13]。近年來(lái)，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道以三氟乙酸(TFA)為酸水解劑[14]，但在水解氨基糖時(shí)不宜使用三氟乙酸。香菇多糖酸水解劑多使用三氟乙酸。

2 衍生試劑的選取

單糖分子結(jié)構(gòu)缺乏發(fā)色官能團(tuán)，不能被現(xiàn)在多數(shù)檢測(cè)器識(shí)別。而通用檢測(cè)器的靈敏度不夠理想，為了提高檢測(cè)靈敏度，可將單糖分子進(jìn)行化學(xué)衍后進(jìn)行檢測(cè)。衍生劑在不斷發(fā)展，胺和類(lèi)胺化合物是較早用于單糖衍生化試劑。隨著研究的加深，出現(xiàn)了更多的衍生化試劑：α-萘胺、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolo, PMP)、1-(4-異丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-(4-isopropyl)phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PPMP)、2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)、苯并吖啶酮-5-乙酰肼(benzoacridinone-5-acetyl hydrazine, BAAH)、3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)等。PMP是最常用的單糖衍生化試劑，與糖的反應(yīng)能在較溫和條件下進(jìn)行且產(chǎn)物有較強(qiáng)紫外吸收，檢測(cè)限能達(dá)到皮摩爾級(jí)[15]。PMP不能衍生修飾果糖、甘露醇和山梨醇，香菇多糖降解產(chǎn)物因不含果糖、甘露醇及山梨醇可以選擇PMP[16]作衍生試劑。此外，α-萘胺[17]、AEC[18]也可用于香菇多糖降解單糖的衍生修飾。

3 單糖的分離檢測(cè)

香菇多糖是由葡聚糖和多種單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的雜環(huán)糖。分析檢測(cè)香菇多糖的方法很多，主要有氣相色譜法(GC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)、高效液相色譜法(HPLC)等。

3.1 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳具有分離快速、靈敏度高及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，主要用于單糖和寡糖的分析檢測(cè)[19-21]。汲晨鋒等采用α-萘胺為衍生試劑，應(yīng)用毛細(xì)管電泳對(duì)香菇多糖單糖組分及含量進(jìn)行分析[17]，香菇多糖單糖組分毛細(xì)管區(qū)帶電泳譜圖見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本符合。

Rha：鼠李糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glu：葡萄糖

3.2 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜法靈敏度高、重現(xiàn)性好，已用于多種多糖單糖組分的分析檢測(cè)[22-23]。氣相色譜法適于揮發(fā)性物質(zhì)的分析檢測(cè)，而單糖沸點(diǎn)高不具備揮發(fā)性需衍生化生成易揮發(fā)物質(zhì)，衍生過(guò)程不僅繁瑣，且衍生樣品要求較高。李健等將香菇多糖水解單糖與六甲基二硅氨烷衍生，用氣相色譜法分析單糖組成及含量[24]。文中還采用了氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法比較分析香菇多糖單糖組成及含量。趙行等將糖腈乙酰化衍生-氣相色譜法用于香菇多糖單糖組成的分析。由于氣相色譜法對(duì)樣品的衍生要求高，單糖色譜峰存有干擾，某些單糖組分需進(jìn)一步確認(rèn)[25]。

3.3 高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜法不僅不需樣品氣化，且方法高效，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，技術(shù)較成熟，因此廣泛用于單糖的分析檢測(cè)。高效液相色譜法的檢測(cè)器種類(lèi)較多，通用型檢測(cè)器有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示差檢測(cè)器，可以直接檢測(cè)單糖分子。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分析糖類(lèi)物質(zhì)不可缺少的檢測(cè)器[26]。通用型檢測(cè)最大的缺點(diǎn)是不僅對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)有響應(yīng)，氨基酸、脂類(lèi)、碳水化合物等等物質(zhì)均有響應(yīng)。香菇除了含有多糖還富含蛋白質(zhì)、脂肪酸等，若采用高效液相直接檢測(cè)法勢(shì)必會(huì)有較大誤差。紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器是高效液相運(yùn)用較廣泛的檢測(cè)器。單糖無(wú)紫外吸收，則需衍生(柱前衍生或者柱后衍生)后方能被紫外檢測(cè)器識(shí)別。單糖常用的衍生的試劑在2中已討論。柱前衍生高效液相色譜法是分析糖類(lèi)物質(zhì)常用的方法[27-29]。

陳志輝等[30]將提純香菇多糖，經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解后與PMP發(fā)生衍生反應(yīng)，再用高效液相-二極管陣列法進(jìn)行分析，共標(biāo)示出13個(gè)特征峰，鑒別了6個(gè)色譜峰：甘露醇、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖。10批香菇多糖樣品HPLC指紋圖片重疊圖如圖2，相似度>0.99，表明香菇多糖PMP柱前衍生HPLC指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性，可作為香菇質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)的參考依據(jù)。高效液相指紋圖譜技術(shù)已成為中藥鑒別及質(zhì)量控制的重要手段。馮賢達(dá)[31]用四種不同的提取法提取香菇多糖，并對(duì)四種工藝提取的香菇多糖進(jìn)行HPLC指紋圖譜對(duì)比分析，研究其單糖組成的變化。單糖成分的區(qū)別會(huì)影響香菇多糖的生物活性，通過(guò)HPLC指紋圖譜的分析可指導(dǎo)企業(yè)對(duì)提取工藝的選取。

圖2 10批香菇多糖樣品HPLC指紋圖譜重疊圖[30]

超高效液相色譜法不僅可以縮短分析時(shí)間而且能提高色譜分離度，減少溶劑的消耗，在中藥化學(xué)成分識(shí)別、指紋圖譜等領(lǐng)域發(fā)展應(yīng)用，促進(jìn)中藥的質(zhì)量控制[32]。趙行等[16]利用超高效液相色譜對(duì)香菇多糖片中單糖組分進(jìn)行分析，完全酸水解法將香菇多糖降解為單糖，PMP柱前衍生，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)香菇多糖的酸水解產(chǎn)物。主要單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，含有少量的巖藻糖和阿拉伯糖。結(jié)果表明PMP柱前衍生-超高效液相色譜法是檢測(cè)香菇多糖片中單糖組分分準(zhǔn)確、可靠、快速的方法。

HPLC法和柱前衍生化技術(shù)結(jié)合在測(cè)定多糖單糖組成方面不斷發(fā)展應(yīng)用，糖類(lèi)衍生化試劑也在不斷創(chuàng)新。張萍等[33]以3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生劑(ACE)，考察了AEC對(duì)不同類(lèi)型單糖的衍生效果，發(fā)現(xiàn)AEC對(duì)中性糖的衍生效果大于酸性糖。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖六種中性單糖-AEC衍生物高效液相色譜分離圖如圖3。香菇多糖水解后生成單糖-AEC衍生物，再由高效液相-二極管陣列法分析檢測(cè)。作者據(jù)此建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析香菇多糖單糖組成，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為香菇多糖的研究及產(chǎn)品評(píng)價(jià)提高了新的參考方法。

a: Gal; b: Man; c: Glc; d: Ara; e: Xyl; f:Rha

4 結(jié)論

香菇多糖單糖組成的分析對(duì)香菇多糖藥物、香菇多糖保健品、香菇藥材原料的鑒定起著重要作用。文中論述了香菇多糖單糖組成分析過(guò)程，水解、衍生、分離、檢測(cè)主要環(huán)節(jié)的技術(shù)的新進(jìn)展。香菇多糖降解主要采用的是酸水解技術(shù)，但隨著生物技術(shù)及人工酶、納米酶的發(fā)展，酶解法可能發(fā)展成降解多糖的常用手段，在溫和的條件下實(shí)現(xiàn)多糖的降解。對(duì)比天然酶，人工酶及納米酶具有價(jià)格便宜、穩(wěn)定性好、循環(huán)利用率高等優(yōu)勢(shì)。未來(lái)有望發(fā)展水解多糖的人工酶或納米酶。隨著色譜技術(shù)的快速發(fā)展，有可能設(shè)計(jì)響應(yīng)單糖的專(zhuān)屬檢測(cè)器，以省去衍生環(huán)節(jié)，不僅簡(jiǎn)化單糖的分析檢測(cè)過(guò)程，而且避免衍生過(guò)程影響分離分析結(jié)果。