青錢(qián)柳葉降血糖作用研究

唐 梅，楊勝祥，趙立春

青錢(qián)柳葉降血糖作用研究

唐 梅1，楊勝祥2，*趙立春1

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西，南寧 530200；2.浙江農(nóng)林大學(xué)理學(xué)院，浙江，杭州 311300)

研究青錢(qián)柳葉雙水相提取物對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用。通過(guò)高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈佐霉素（STZ）建立小鼠糖尿病模型，設(shè)置青錢(qián)柳葉雙水相提取物高、中、低劑量組灌胃，連續(xù)14 d后測(cè)定空腹血糖值，檢測(cè)血清中胰島素（INS）、總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、極低密度脂蛋白含量(VLDL-C)，采用HE染色法觀察實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠肝臟和胰腺的病理學(xué)變化。青錢(qián)柳葉雙水相提取物中劑量能明顯改善2型糖尿病小鼠體重減輕這一癥狀（＜0.01），低劑量組降低糖尿病小鼠空腹血糖（＜0.05），高劑量組顯示出降低血清胰島素的作用（＜0.05），青錢(qián)柳葉雙水相提取物能降低糖尿病小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，增加高密度脂蛋白含量。二甲雙胍組和青錢(qián)柳葉雙水相提取物高、中、低劑量組小鼠的肝臟和胰腺的病變較模型組有不同程度的減輕。青錢(qián)柳葉雙水相提取物具有降低小鼠空腹血糖、降脂、改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島細(xì)胞的作用，其降血糖的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

青錢(qián)柳葉；雙水相提??；降血糖

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由多源性病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由胰島素分泌和作用缺陷引起。糖尿病一般可分為胰島素依賴(lài)性（1型，IDDM）及非胰島素依賴(lài)性（2型，NIDDM，T2DM）兩種類(lèi)型，而2型糖尿病患者至少占糖尿病患者總數(shù)的90%以上。2017年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（Internation Diabetes Federration，IDF）發(fā)布的第8版糖尿病概覽數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)共有4.25億成年人患有糖尿病，其中我國(guó)糖尿病患病人數(shù)達(dá)到1.14億，仍是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家，預(yù)測(cè)到2045年全球糖尿病人數(shù)將增至近7億[1]。此外，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)[2-3]，兒童和青少年的患病率亦有所增高。在農(nóng)村，因?yàn)獒t(yī)療知識(shí)的缺乏，沒(méi)有體檢的意識(shí)，可能使得一部分人成為隱形糖尿病患者，未能納入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中[4]。2型糖尿病起病隱匿，大多數(shù)患者無(wú)癥狀或癥狀較輕，不少患者因身體檢查、伴發(fā)病、慢性并發(fā)癥而被發(fā)現(xiàn)。胰島素缺乏和組織的胰島素抵抗會(huì)引起不同程度的糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水及電解質(zhì)等代謝紊亂綜合征，久病者常并發(fā)眼、腎、心腦血管、神經(jīng)等組織器官慢性進(jìn)行性病變，最后引起多系統(tǒng)損傷，危害人類(lèi)健康。糖尿病已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，針對(duì)它的防治工作刻不容緩。

青錢(qián)柳((Batai.) Iljinskaja ) 系雙子葉植物綱（Dicoty ledoneae）胡桃科（Juglandaceae）青錢(qián)柳屬植物，另有甜茶樹(shù)、青錢(qián)李、山麻柳、搖錢(qián)樹(shù)等稱(chēng)。青錢(qián)柳是一種高大速生喬木，奇數(shù)羽狀復(fù)葉，廣泛分布于中國(guó)南方各省的海拔500~2500 m的山區(qū)和溪谷[5]。青錢(qián)柳是冰川世紀(jì)的孑遺樹(shù)種，它是我國(guó)特有的單種屬植物，也是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，屬于國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹(shù)種，有植物界的大熊貓、醫(yī)學(xué)界的第三棵樹(shù)之稱(chēng)。2007年，江西省修水神茶(集團(tuán))公司用青錢(qián)柳葉作為主要原料，研發(fā)生產(chǎn)了具有降糖、降壓和減肥作用的一系列神茶，是我國(guó)保健茶中首個(gè)獲得美國(guó)FDA頒發(fā)質(zhì)量證書(shū)的產(chǎn)品。青錢(qián)柳的藥理作用研究主要集中在降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗菌、抗癌作用等方面。青錢(qián)柳被醫(yī)學(xué)界稱(chēng)為“天然胰島素”，其降糖作用是多成分、多位點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用的結(jié)果，研究表明其降血糖活性成分為多糖類(lèi)[6-8]、黃酮類(lèi)[9-11]、三萜及甾體[12-13]、內(nèi)酯等化合物，一些微量元素[14]也與之相關(guān)。

兩種高聚物溶于水，或高聚物與某種高價(jià)無(wú)機(jī)鹽溶于水并靜止一段時(shí)間后自然形成兩種不相溶的上下兩相，其中兩相都含有大量水分，這種兩相體系被稱(chēng)作雙水相體系（Aqueous two-phase system, ATPS）。由于兩相對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)的溶解性存在差異，雙水相體系被當(dāng)作一種液/液萃取分離技術(shù)使用，它具備能規(guī)模放大化、連續(xù)化操作、環(huán)保綠色等優(yōu)點(diǎn)[15]。自1956年Albertsson[16]將此體系率先用于葉綠素的分離后，之后雙水相體系被廣泛應(yīng)用于分離純化蛋白質(zhì)、基因、生物納米分子、細(xì)胞和天然產(chǎn)物等領(lǐng)域[17-19]。它在中藥活性成分方面主要集中在黃酮、生物堿、萜類(lèi)、多酚、色素和蒽醌等幾類(lèi)化合物的研究應(yīng)用。傳統(tǒng)的雙水相體系主要是雙高聚物和聚合物/鹽雙水相體系，近年來(lái)小分子親水有機(jī)溶劑和鹽、離子液體和鹽組成的雙水相體系應(yīng)用更為廣泛。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系提取青錢(qián)柳葉總黃酮，優(yōu)化提取條件后，黃酮提取率達(dá)到3.00%，在優(yōu)化的工藝條件下提取青錢(qián)柳葉提取物，并進(jìn)行小鼠降血糖研究。

1 材料

1.1 藥材與試劑

青錢(qián)柳干燥葉，2017年4月購(gòu)于廣西百色市隆林縣德峨鄉(xiāng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)袁經(jīng)權(quán)教授鑒定為胡桃科青錢(qián)柳屬植物青錢(qián)柳葉。乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、石油醚（成都市科隆化學(xué)品有限公司）、乙酸乙酯、二氯甲烷（廣東光華科技股份有限公司）。高脂大小鼠飼料（北京華阜康生物技術(shù)科技股份有限公司，SCXK（京）2014-0008），鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370），鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich, WXBC6558V）。檸檬酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20181006），檸檬酸三鈉（廣東光華科技股份有限公司，20170414）。小鼠T-CHO、TG、HDL-C、LDL-C測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，20190221~20190225）。小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、小鼠極低密度脂蛋白（VLD-L）酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：GYV3LWB6SH）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠140只，雌雄各半，3~4 w齡，體重18~22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SCXK（湘）2016-0002）。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好、相對(duì)濕度為50%~60%、室溫為23~25 ℃、嚴(yán)格12 h光照12 h黑暗的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房。

1.3 儀器

電子天平（瑞士Mettler toledo），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph），冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ）。羅氏卓越精采型血糖儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司，200687），羅氏卓越精采型血糖試紙（葡萄糖脫氫酶法）（Roche Diabetcs Care Gmbh，477232），羅氏血糖儀一次性采血針（蘇州施萊醫(yī)療器械有限公司，E3023）。高速冷凍離心機(jī)、移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)eppendorf）。制冰機(jī)、-80℃冰箱（日本松下），雷磁PHS-3E計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Epoch 2，（美國(guó)Biotek）。石蠟切片機(jī)（Thermo），組織包埋機(jī)，組織脫水機(jī)（意大利Diapath S. p. A.）。

2 方法

2.1 藥材提取與分離

取過(guò)40目篩的青錢(qián)柳葉粉末1 kg，按前期優(yōu)化所得的雙水相提取工藝：無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.00%，鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.00%，超聲時(shí)間52 min，液料比33:1，提取過(guò)濾，分離上下相，上相除鹽；然后用石油醚萃取，棄取石油醚部位，水層用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯部位濃縮、干燥即得青錢(qián)柳葉粗提物。

2.2 糖尿病小鼠造模與分組治療

小鼠經(jīng)過(guò)3 d適應(yīng)期后，隨機(jī)對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)分組，取12只小鼠作為空白組（BG），飼喂普通飼料。剩余小鼠全部飼喂高脂高糖飼料，喂養(yǎng)1個(gè)月后，小鼠禁食12 h，按體重100 mg/kg 劑量予腹腔注射鏈佐霉素（STZ）溶液（pH4.5，檸檬酸鈉緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用），空白組小鼠注射等量檸檬酸鈉緩沖液，注射完畢后立刻恢復(fù)小鼠飲食，注射72 h后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖值，空腹血糖≥11.1 mmol/L且連續(xù)多食、多飲、多尿癥狀的小鼠即為造模成功。

取造模成功的小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組（MG）、二甲雙胍組（PG）、青錢(qián)柳葉提取物高劑量組（HDG）、中劑量組（MDG）、低劑量組（LDG），每組12只。高、中、低劑量組分別用青錢(qián)柳葉提取物600、400、200 mg/kg劑量灌胃；二甲雙胍組以二甲雙胍200 mg/kg劑量灌胃；模型組和空白組灌胃等劑量的超純水。各組按0.2 mL/10g灌胃給藥，每天灌胃1次，連續(xù)14 d。

2.3 樣本采集與處理

每天觀察各組小鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度、毛色、飲食、飲水、尿量等的改變，定時(shí)稱(chēng)量小鼠體重。造模前、灌胃7 d、灌胃14 d，測(cè)定空腹血糖。小鼠灌胃14 d后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血。取完血后，小鼠斷頸處死，解剖，觀察其體內(nèi)主要臟器發(fā)育情況。取肝臟、腎臟、脾臟、胰腺，剔除脂肪、筋膜，用生理鹽水洗滌，濾紙吸干水分后稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。全血凝固后在4 ℃，3500 r/min條件下離心15 min，吸取上清液，置于-80℃冰箱保存待測(cè)。血清中INS、T-CHO、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C含量的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

將小鼠的一部分肝臟、胰腺組織固定在4%多聚甲醛中，24 h后常規(guī)洗滌、脫水、石蠟包埋。對(duì)載玻片編號(hào)并對(duì)包埋組織進(jìn)行切片，片厚5 μm，浸入二甲苯兩次各5 min、無(wú)水乙醇兩次各3 min、95%、80%乙醇各3 min，接著用流水充分沖洗。然后用蘇木精液染色3~5 min，流水洗去載玻片上的多余染液，1%鹽酸乙醇分化10 s反藍(lán)，流水沖洗3~5 min。再用1%曙紅液染色1~5 min，充分水洗。常規(guī)梯度乙醇脫水，80%乙醇3~5 s，95%乙醇兩次5~10 s、1~3 min，100%乙醇兩次各1~3 min。松節(jié)油透明兩次各2 min，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察小鼠肝臟、胰腺的病理變化。

所有切片均由病理科醫(yī)師盲法讀片，對(duì)肝細(xì)胞變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度分別進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。肝細(xì)胞水腫變性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)[20]見(jiàn)表1，肝炎癥活動(dòng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[21]見(jiàn)表2，兩個(gè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照原文獻(xiàn)稍作修改。肝炎癥活動(dòng)分為匯管區(qū)（P）、小葉內(nèi)（L）、碎屑?jí)乃溃≒N）及橋接壞死（BN）4項(xiàng)，每項(xiàng)依病變程度為1、2、3、4分，計(jì)分公式為P+L+2（PN+BN），因?yàn)锽N和PN的嚴(yán)重度與預(yù)后直接有關(guān)，故其計(jì)分2倍于其他病變，在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)二者依其輕、中、重程度直接計(jì)以2、6、8分，總分為4項(xiàng)計(jì)分之和。

表1 肝細(xì)胞水腫變性程度評(píng)分表

表2 肝炎癥評(píng)分表

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠體重、空腹血糖的影響

小鼠飼喂高脂飼料后體重快速增加。造模成功后，空白組小鼠的形態(tài)正常、毛色光滑、動(dòng)作敏捷、好動(dòng)、精神狀態(tài)良好，體重仍然呈增長(zhǎng)狀態(tài)；而模型組小鼠則變得消瘦、體毛松散無(wú)光澤、尾巴濕冷、活動(dòng)度低常靜臥。造模成功后，每天更換墊料，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠墊料明顯不及空白組的干燥潔凈；每天更換等量飲水，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠飲水比空白組小鼠多。青錢(qián)柳葉提取物低、中、高劑量組的小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。灌胃兩周后模型組和空白組小鼠體重存在差異(＜0.05)，青錢(qián)柳葉提取物中劑量組小鼠體重略有增加(＜0.05)，空白組與二甲雙胍、青錢(qián)柳葉低中高組小鼠體重有顯著差異（＜0.01）。結(jié)果提示，青錢(qián)柳葉提取物在一定劑量下能改善糖尿病小鼠體重減輕的癥狀。小鼠體重變化見(jiàn)表3和圖1。

小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)，空腹血糖都在正常范圍，高脂飼料喂養(yǎng)一個(gè)月后，有少數(shù)小鼠的空腹血糖值已經(jīng)超過(guò)11.1 mmol/L。腹腔注射STZ后，部分小鼠的血糖非常高甚至超過(guò)血糖儀的測(cè)量上限High（33.3 mmol/L），在計(jì)算中為方便數(shù)值化計(jì)算將High值計(jì)為33.4 mmol/L。模型組在造模后、灌胃2周后的空腹血糖和空白組相比都存在顯著差異，表明模型組高血糖狀態(tài)穩(wěn)定。灌胃2周后模型組和青錢(qián)柳提取物低劑量組具有差異（＜0.05），提示青錢(qián)柳葉提取物在一定劑量下有降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用。青錢(qián)柳葉提取物對(duì)糖尿病小鼠的影響見(jiàn)表4和圖2。

表3 小鼠體重

=12，與空白組比較：*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05，##＜0.01

表4 小鼠血糖

=12，與空白組比較：*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05，##＜0.01

圖1 小鼠體重

圖2 小鼠血糖含量

3.2 對(duì)小鼠血清胰島素的影響

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣本OD值求得胰島素含量。模型組、陽(yáng)性組、低劑量組小鼠的血清胰島素含量明顯高于空白組（＜0.01），中劑量組高于模型組（＜0.05），這些糖尿病小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗。灌胃兩周，青錢(qián)柳葉提取物高劑量組小鼠的血清胰島素與模型組相比含量顯著下降（＜0.01），接近空白組胰島素水平。青錢(qián)柳葉提取物對(duì)小鼠血清胰島素的影響如表5和圖3所示。

表5 青錢(qián)柳提取物對(duì)小鼠血清胰島素、各血脂指標(biāo)的影響

=12，與空白組比較：*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05，##＜0.01；與陽(yáng)性組比較，^＜0.05，^^＜0.01

圖3 小鼠血清INS、VLDL-C

3.3 對(duì)小鼠血脂的影響

從表5，圖3、4可知，與空白組相比，糖尿病小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量明顯升高（＜0.01），高密度脂蛋白有所升高（＜0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組小鼠血清的T-CHO、TG和LDL-C顯著降低，HDL-C升高；青錢(qián)柳提取物低劑量組血清中T-CHO、LDL-C水平顯著降低（＜0.01），TG降低（＜0.05），HDL-C顯著升高（＜0.01）；青錢(qián)柳提取物中劑量組T-CHO、TG、LDL-C水平顯著降低（＜0.01），HDL-C顯著升高（＜0.01）；青錢(qián)柳提取物高劑量組TG顯著降低（＜0.01），T-CHO、LDL-C水平降低（＜0.05），HDL-C顯著升高（＜0.01）。

圖4 小鼠血清T-CHO、TG、LDLC和HDLC比較

3.4 臟器指數(shù)

臟器指數(shù)指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器官濕質(zhì)量與體質(zhì)量的比例，主要用于反映藥物對(duì)內(nèi)臟器官的損害而導(dǎo)致內(nèi)臟器官質(zhì)量變化的一個(gè)客觀指標(biāo)。與空白組相比，模型組小鼠的肝臟、脾臟臟器指數(shù)具有差異（＜0.05），脾臟差異顯著（＜0.01），這提示模型組小鼠的內(nèi)臟可能已經(jīng)受到損傷。與模型組相比，二甲雙胍組和青錢(qián)柳高劑量組小鼠的脾臟、腎臟指數(shù)有明顯差異（＜0.01），胰腺指數(shù)有顯著性差異（＜0.05）；低劑量和中劑量組的肝臟、脾臟、腎臟指數(shù)都有明顯的差異（＜0.01），中劑量組小鼠胰腺與模型組差異明顯（＜0.01）。與陽(yáng)性組比較，青錢(qián)柳提取物劑量組，除了肝臟系數(shù)有差異，其余三個(gè)指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)青錢(qián)柳提取物有保護(hù)糖尿病小鼠肝臟、胰腺、腎臟和胰腺的作用，青錢(qián)柳葉有減少2型糖尿病內(nèi)臟并發(fā)癥的可能。臟器指數(shù)如表6所示。

表6 臟器指數(shù)

=12，與空白組比較：*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05，##＜0.01；與陽(yáng)性組比較，^＜0.05，^^＜0.01

3.5 小鼠肝臟、胰腺病理形態(tài)學(xué)分析

觀察小鼠肝臟外觀形態(tài)可知，空白組小鼠肝臟質(zhì)地柔軟而有彈性，顏色深紅，表面光滑，邊緣銳利；糖尿病小鼠肝臟體積增大，質(zhì)地較硬，顏色粉紅，表明有白色斑點(diǎn)，邊緣變鈍；二甲雙胍組和青錢(qián)柳葉提取物組肝臟變化較模型組有所減輕。觀察肝臟病理學(xué)切片，空白組小鼠（圖5 BG）肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大且呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞排列整齊，邊界清晰。模型組小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重水腫，匯管區(qū)和小葉內(nèi)出現(xiàn)一些炎細(xì)胞（圖5 MG），外形不規(guī)則，結(jié)構(gòu)模糊，胞核固縮，排列混亂，界限不清；給藥組與模型組相比，胞核固縮程度較輕，細(xì)胞水腫程度較輕，排列較整齊，肝臟損傷程度減輕，說(shuō)明青錢(qián)柳葉提取物對(duì)糖尿病小鼠的肝臟有一定的保護(hù)作用。肝臟評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表7。

觀察小鼠胰腺外觀形態(tài)可知，空白組小鼠胰腺組織邊界清晰，表面光滑，質(zhì)地致密，顏色均勻，切割易分離、無(wú)粘連；糖尿病模型組小鼠胰腺出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，質(zhì)地糖稀，邊界不清晰，顏色變暗，與表面脂肪組織粘連、切割時(shí)不易分離；二甲雙胍組和青錢(qián)柳葉提取物組小鼠的胰腺形態(tài)變化較輕。觀察小鼠胰腺病理切片，空白組（圖6 BG）胰島細(xì)胞數(shù)量豐富，分布均勻，呈圓形、橢圓形或索狀，細(xì)胞核染色質(zhì)清晰，胞漿豐富，邊界清晰，排列整齊，未見(jiàn)明顯細(xì)胞腫脹、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組胰島數(shù)目明顯減少，而且胰島細(xì)胞面積變得很小，形狀不規(guī)則，排列紊亂，可見(jiàn)細(xì)胞空泡變性，有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。青錢(qián)柳葉提取物低、中、高劑量組和二甲雙胍組的胰島細(xì)胞較多，如在青錢(qián)柳葉提取物低劑量組的一個(gè)視野中（圖6 LDG）可以看到兩個(gè)胰島細(xì)胞，中劑量組（圖6 MDG）可以看到4個(gè)胰島細(xì)胞?？梢?jiàn)胰島結(jié)構(gòu)比較完整，排列較整齊，由此表明青錢(qián)柳葉提取物能夠保護(hù)小鼠胰腺形態(tài)，甚至逆轉(zhuǎn)胰島β細(xì)胞的損傷。由于糖尿病小鼠胰腺病理切片評(píng)分較少，暫統(tǒng)計(jì)了胰島個(gè)數(shù)，后可用專(zhuān)門(mén)軟件計(jì)算各個(gè)胰島細(xì)胞面積作為考察指標(biāo)之一。

表7 肝臟、胰腺切片評(píng)分

圖5 小鼠肝臟切片

圖6 小鼠胰腺切片

4 討論

用高脂飼料與STZ聯(lián)合誘導(dǎo)的方法建立了2型糖尿病模型，通過(guò)對(duì)2型糖尿病小鼠分組予以高、中、低劑量的青錢(qián)柳葉的雙水相提取物灌胃，研究其對(duì)2型糖尿病的干預(yù)作用。影響STZ造模的因素很多，如STZ給藥劑量、推注時(shí)間、STZ批次、動(dòng)物個(gè)體敏感性、病程長(zhǎng)短、生長(zhǎng)環(huán)境，小鼠胰島β細(xì)胞受損程度不一，對(duì)同一治療產(chǎn)生的效果可能不一。在該試驗(yàn)中，灌胃給藥兩周后，雖然給藥組小鼠的體重和空白組還是存在顯著差異，但能觀察到給藥組小鼠的體重呈回升趨勢(shì)。糖尿病小鼠的空腹血糖值與空白組小鼠存在顯著差異，但由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可判斷給藥后小鼠血糖值呈下降趨勢(shì)，或由于血糖值太高，甚至實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)幾只小鼠血糖超過(guò)血糖儀閾值（33.3 mmol/L），中藥見(jiàn)效普遍較緩，此處應(yīng)延長(zhǎng)給藥時(shí)間，考察其降血糖效果。青錢(qián)柳葉經(jīng)過(guò)乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系提取后，總黃酮提取率達(dá)到3.00%，黃酮進(jìn)行富集后，可以認(rèn)為青錢(qián)柳葉粗提物中發(fā)揮藥理作用的大多為黃酮類(lèi)成分。檢測(cè)小鼠血清中的血脂指標(biāo)，可見(jiàn)模型組與空白組相比較，TG、T-CHO、LDL-C和VLDL-C上升幅度很大，HDL-C明顯降低。給藥兩周后，給藥組和模型組的血脂含量存在顯著差異，表明青錢(qián)柳葉雙水相提取物發(fā)揮了降血脂的作用。

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成，STZ破壞胰島β細(xì)胞，引起胰島素分泌減少，模型組、二甲雙胍組、青錢(qián)柳葉提取物低劑量組小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗，中劑量組小鼠胰島素也顯示出和空白組有差異。模型組小鼠胰島素和青錢(qián)柳葉雙水相提取物高劑量組存在顯著差異，提示高劑量組能夠改善胰島素抵抗。對(duì)各組小鼠的肝臟和胰腺病理切片進(jìn)行觀察，直接可見(jiàn)模型組各小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度水腫、匯管區(qū)或小葉內(nèi)出現(xiàn)不同量炎癥細(xì)胞，給藥組小鼠水腫和炎癥的程度較輕，說(shuō)明青錢(qián)柳葉雙水相提取物對(duì)肝臟有保護(hù)作用。模型組小鼠的胰島細(xì)胞較空白組數(shù)量驟減，面積變小，給藥組小鼠的胰島細(xì)胞較模型組多且面積較大，說(shuō)明給藥后胰島細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度逆轉(zhuǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)表明，青錢(qián)柳葉雙水相提取物對(duì)糖尿病小鼠有降低空腹血糖、降低胰島素、降血脂的作用，其作用機(jī)制待后期免疫組化進(jìn)行更深入研究。

[1] International Diabetes Federation. Press Release: New IDF figures show continued increase indiabetes across the globe, reiterating the need for urgent action[M]. IDF atlas qth edition and other resources, 2017: 14.

[2] 董彥會(huì),王政和,楊忠平,等. 中國(guó)兒童青少年糖尿病患病率Meta分析[J].中國(guó)學(xué)校衛(wèi)生,2016, 37(11): 1676-1679.

[3] 徐奚如,王旭. 中國(guó)兒童及青少年糖尿病發(fā)病現(xiàn)狀與防治策略[J]. 山東醫(yī)藥, 2011,51: 98-99.

[4] 唐佳慧,胡欣,戚燕. 農(nóng)村老年糖尿病患者自我管理能力的質(zhì)性研究[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2015,36(06):88-91.

[5] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1979: 18-19.

[6] 張小芳,段小群,盧曦,等. 青錢(qián)柳多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖水平和胰腺組織形態(tài)的影響[J]. 華夏中醫(yī), 2010, 23(1): 15-17.

[7] 張小芳. 廣西青錢(qián)柳降血糖有效成分及作用機(jī)制的研究[D]. 桂林：桂林醫(yī)學(xué)院. 2010.

[8] LI L, ZHAO L, XIE M Y, et al. Bioactivity of reducing blood sugar and elements speciation analysis of the extract from(Batal.) Iljinsk leaves [J]. Journal of Xiamen University (Natural Science),2003,42(1): 73-77.

[9] 楊武英,上官新晨,徐明生,等. 青錢(qián)柳黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶活性及小鼠血糖的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2007, 29(5) : 507-509.

[10] 沈兵,趙巍,歐文斌,等. 青錢(qián)柳中α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2013, 40(3): 275-280.

[11] 易醒,謝明勇,辜清,等. 青錢(qián)柳對(duì)膽固醇調(diào)節(jié)作用的初步研究[J]. 中國(guó)商辦工業(yè), 2000(4): 51-52.

[12] 王曉敏,舒任庚,蔡永紅,等. 青錢(qián)柳水提液對(duì)糖尿病小鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(12): 3146-3147.

[13] FU X, YIN Z P, SHENGGUAN X C, et al. Stimulation of glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes by triterpenoids fromleaves[J]. Mordern Food Science and Technology. 2014, 30(80)：31-37.

[14] 李磊,謝明勇,孫振華,等. 保健食品青錢(qián)柳中稀土元素的組成及溶出特性[J]. 中國(guó)畜產(chǎn)與食品, 2000, 7(3): 101-102.

[15] 戈延茹,曹恒杰. 雙水相萃取技術(shù)及其在藥物提取分離中的應(yīng)用近況[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2009, 26(8): 623-627.

[16] Albertsson P A. Chromatography and partition of cells and cell fragments [J]. Nature, 1956, 177(4513): 771-774.

[17] Asenjo J A, Andrews B A. Aqueous two-phase systems for protein separation: Phase separation and applications [J]. J Chromatogy A, 2012, 1238: 1-10.

[18] Federico R R, Jorge B, Oscar A, et al. Aqueous two-phase affinity partitioning systems: Current applications and trends [J]. J Chromatogy A, 2012, 1244: 1-13.

[19] Aguilar O, Rito-Palomares M. Aqueous two-phase systems strategies for the recovery and characterization of biological products from plants [J]. J Sci Food Agric , 2010, 90(9): 1385-1392.

[20] Diehl M A, Goodman Z, Ishak K G. Alcohollike liver disease in nonalcoholics. A clinical and histologic comparison with alcohol-induced liver injury[J]. Gastroenterology, 1988, 95(4): 1056-1062.

[21] 于淼. 解毒通絡(luò)調(diào)肝法干預(yù)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病胰島素抵抗大鼠肝內(nèi)炎癥并發(fā)癥發(fā)病途徑的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 長(zhǎng)春:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué). 2007.

HYPOGLYCEMIC EFFECT OF EXTRACTS FROM(BATAI.) ILJINSKAJA LEAVES

TANG Mei1, YANG Shen-xiang2,*ZHAO Li-chun1

(1. School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning, Guangxi 530222, China; 2. School of Science, Zhejiang A & F University, Hangzhou, Zhejiang 311300, China)

The effects of aqueous two-phase extracts of(Batai.) Iljinskaja leavesondiabetes mellitus mice were studied.The mice were fed with high fat diet, then intraperitoneal injected streptozotocin (STZ) to establish the T2DM animal models. After two weeks, the contents of insulin (INS), total cholesterol (T-CHO), serum triglyceride (TG), high density lipoprotein (HDL-C), low density lipoprotein (LDL-C) and very low density lipoprotein (VLDL-C) were measured. The changes of liver and pancreatic tissues pathology in experimental diabetic mice were observed by the immunohistochemical method.Middle dose group ofleaves aqueous two-phase extracts could significantly improve the loss of diabetic mice weights (＜0.01). Low dose group lowered the fasting blood glucose and high dose group lowered INS (＜0.05).leaves aqueous two-phase extracts could reduce the contents of T-CHO, TG, LDL-C and increased HDL-C. T2DM mice hepatocytes showed different degrees of edema and degeneration, the portal areas and lobule occurred inflammatory cell infiltration. The liver changes of mice administrated byleaves extracts and metformin hydrochloride alleviated compared with the model group. Compared with normal mice, there were fewer islets, irregular morphology, uneven cell distribution in the islets of T2DM mice.leaves aqueous two-phase extracts possessed lowering fasting blood glucose, lowering lipid, improving insulin resistance and protective effects on STZ diabetic mice, while its specific mechanisms were worth for further investigation.

(Batai.) Iljinskaja leaves; aqueous two-phase extracts; hypoglycemic effect

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.05.015

1674-8085(2020)05-0083-09

2020-02-12；

2020-04-27

廣西一流學(xué)科項(xiàng)目(05019018A5);“岐黃工程”創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2018002）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)2018年自治區(qū)級(jí)碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSW2018169）

唐 梅(1993-)，女，廣西桂林人，碩士研究生，主要從事中藥化學(xué)成分提取及活性研究(E-mail: GXtangmei@163.com);

楊勝祥(1982-)，男，安徽安慶人，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)生物學(xué)研究(E-mail：shengxiangyang2000@163.com);

*趙立春(1980-)，男，吉林長(zhǎng)春人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)成分提取及活性研究(E-mail:hyzlc@126.com).