含附子-半夏溫陽化痰湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠的毒性研究*

余 婷，苗 青，王瑞海，許 京，陳 怡，朱莉莉，許紅英，張家瑋，肖 蘇，劉麗梅△

(1. 湖北省荊州市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊州 434000；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

溫陽化痰湯(藥物組成：黑順片、法半夏、陳皮、茯苓、甘草、蒼術(shù)、白術(shù)、白芥子、淫羊藿、皂角刺、絡(luò)石藤、巴戟、菟絲子、生山楂、神曲)是荊楚“劉氏婦科”奠基人、全國名老中醫(yī)劉云鵬用于治療多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)的臨床經(jīng)驗(yàn)處方。該方以反藥組合“附子-半夏”為君藥，用于臨床10余年療效顯著，并無不良反應(yīng)出現(xiàn)。然而附子與半夏同用屬“十八反”配伍禁忌范疇，其能否同用歷來頗有爭議[1-2]，其用藥安全性值得探討。

研究發(fā)現(xiàn)，附子中主要的毒性成分為雙酯型二萜類生物堿[3]，半夏中的主要毒性成分可能為特殊晶型的草酸鈣針晶[4]。據(jù)報(bào)道，附子半夏配伍后，雙酯型二萜類生物堿的含量明顯增高，毒性增強(qiáng)[5]。實(shí)驗(yàn)表明，附子-半夏藥對(duì)配伍用藥后對(duì)大鼠心臟有明顯的毒性反應(yīng)，對(duì)腎臟和肝臟形態(tài)學(xué)也有影響[6]。因此，本研究在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，基于PCOS大鼠模型，探討溫陽化痰湯對(duì)附子-半夏毒性靶器官(心、肝、腎)的毒性作用，以評(píng)價(jià)該方安全性，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黑順片、法半夏、陳皮、茯苓、甘草、蒼術(shù)、白術(shù)、白芥子、淫羊藿、皂角刺、絡(luò)石藤、巴戟、菟絲子、生山楂、神曲均購自北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號(hào)分別為1609014、1609042、1609050、1610035、1609010、1607053、1607027、1512013、1608042、1610039、1603023、1608079、1608006、1609032、1606028，芙瑞來曲唑片購自浙江恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)16113058。

1.2 儀器設(shè)備

AU480全自動(dòng)生化儀(奧林巴斯株式會(huì)社，東京，日本)；Pannoramic 250 Pannoramic MIDI 病理切片掃描儀(3D HISTECH, Inc.，布達(dá)佩斯，匈牙利)；Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，中國香港)。

1.3 動(dòng)物

8周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量(230±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0013。本實(shí)驗(yàn)已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

2 方法

2.1 中藥提取液的制備

溫陽化痰湯的制備方法：黑順片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min后加入已浸泡30 min的其他藥物，繼續(xù)煎煮30 min，趁熱過濾得濾液I；濾渣加入6倍量水煎煮30 min，趁熱過濾得濾液II；合并2次濾液加熱濃縮即得溫陽化痰湯，其生藥質(zhì)量濃度為1.62 g·mL-1。

附子-半夏合煎液的制備方法：黑順片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min后加入已浸泡30 min的法半夏9 g，繼續(xù)煎煮30 min，趁熱過濾得濾液I；濾渣加入6倍量水煎煮30 min，趁熱過濾得濾液II；合并2次濾液加熱濃縮即得附子-半夏合煎液，其生藥質(zhì)量濃度為0.171 g·mL-1。

2.2 PCOS動(dòng)物模型的建立

圖1示，本實(shí)驗(yàn)選用來曲唑誘導(dǎo)法建立PCOS大鼠模型[7-8]。正常飼養(yǎng)SD雌性大鼠，每天早上進(jìn)行陰道涂片觀察細(xì)胞的周期變化(4～5 d)，完成連續(xù)2個(gè)正常動(dòng)情周期的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，未完成完整動(dòng)情周期的大鼠剔除。將參與實(shí)驗(yàn)的大鼠隨機(jī)取出20只，其余大鼠建立PCOS模型：用溶于1%羧甲基纖維素中的來曲唑溶液按照每日1 mg·kg-1的劑量連續(xù)灌胃21 d，同時(shí)進(jìn)行陰道涂片觀察，顯示動(dòng)情周期無規(guī)律(即可見大量白細(xì)胞，偶見少量角化細(xì)胞，處于動(dòng)情間期，提示無排卵，見圖1A)的大鼠為PCOS大鼠，動(dòng)情周期規(guī)律(即可見大部分為角化細(xì)胞，處于動(dòng)情期，見圖1B)的大鼠剔除。

注：A.大鼠處于動(dòng)情間期；B.大鼠處于動(dòng)情期圖1 大鼠陰道涂片比較(瑞氏染色 ×400)

2.3 大鼠分組與給藥

20只動(dòng)情周期規(guī)律的正常大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和溫陽化痰湯正常組各10只，分別連續(xù)4周灌胃生理鹽水和溫陽化痰湯水煎液；挑選30只造模成功的PCOS大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、溫陽化痰湯PCOS組和附子-半夏PCOS組3組各10只，分別連續(xù)4周灌胃生理鹽水、溫陽化痰湯水煎液和附子-半夏合煎液。

2.4 血液生化指標(biāo)檢測

末次給藥后禁食12 h(不禁水)，分別對(duì)各組大鼠麻醉后取血，離心分離血清，用全自動(dòng)生化儀分別檢測各組大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的水平。

2.5 主要臟器病理檢測

各組大鼠取血后，立即打開腹腔摘取心臟、肝臟和腎臟，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血液生化指標(biāo)結(jié)果

圖2示，給藥4周后檢測各組大鼠血液生化指標(biāo)。

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PCOS組比較：△P<0.05；與溫陽化痰湯比較：#P<0.05，##P<0.01圖2 各組大鼠血液生化指標(biāo)比較

(1)心肌損害指標(biāo)CK-MB和LDH：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均降低，其中LDH降低顯著(P<0.05)；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均顯著升高(P<0.01)。

(2)肝功能指標(biāo)ALT和AST：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著降低(P<0.05)；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著升高(P<0.01)。

(3)腎功能指標(biāo)BUN和CR：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中附子-半夏PCOS組升高顯著(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中CR含量升高顯著(P<0.05)。

3.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

圖3示，經(jīng)HE染色后觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰且位于細(xì)胞中央；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，部分核仁消失，心肌纖維間隔增寬，可見部分肌纖維壞死，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠心肌纖維間隔及心肌纖維排列尚可，與模型組比較心肌病理損傷程度明顯減輕；附子-半夏PCOS組大鼠心肌細(xì)胞排列較為紊亂，部分發(fā)生彎曲呈波浪狀，心肌纖維增粗，與溫陽化痰湯PCOS組比較細(xì)胞間隙增大，橫紋消失，大量炎性細(xì)胞浸潤；溫陽化痰湯正常組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，與正常組比較心肌纖維增粗細(xì)胞間隙變寬、橫紋模糊，伴有炎癥細(xì)胞浸潤。

3.3 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化

圖4示，經(jīng)HE染色后，觀察各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，正常組大鼠肝細(xì)胞索呈放射狀整齊排列，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肝細(xì)胞索排列紊亂，可見明顯的大泡性脂肪變性，匯管區(qū)膠原纖維顯著增生并向小葉內(nèi)延伸，有較多炎細(xì)胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠肝細(xì)胞索排列較整齊，與模型組比較肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，有散在的炎細(xì)胞浸潤；附子-半夏PCOS組肝細(xì)胞索排列紊亂，可見明顯的大泡性脂肪變性，中央靜脈周圍輕度水腫，并伴有炎性細(xì)胞浸潤；溫陽化痰湯正常組肝細(xì)胞排列紊亂，與正常組比較匯管區(qū)周圍膠原增生，有大量炎性細(xì)胞浸潤。

3.4 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

圖5示，經(jīng)HE染色后觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化，正常組大鼠腎小球無明顯病理改變，結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管開放；模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜區(qū)增寬，腎小管上皮細(xì)胞界限不清，少量細(xì)胞壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)無明顯異常，基底膜增厚程度顯著改善；附子-半夏PCOS組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞高度增生，腎小管上皮細(xì)胞界限不清，胞漿疏松，少量細(xì)胞壞死；溫陽化痰湯正常組大鼠腎小球基底膜稍增厚，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，胞漿疏松、淡染。

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖3 各組大鼠心臟切片比較(HE染色，×200)

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖4 各組大鼠肝臟切片(HE染色，×200)

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖5 各組大鼠腎臟切片比較(HE染色，×200)

4 討論

PCOS是婦科常見的內(nèi)分泌疾病，以月經(jīng)紊亂、不孕、多毛、肥胖、痤瘡、雄激素過高、雙側(cè)卵巢持續(xù)增大及持續(xù)無排卵為臨床特征，嚴(yán)重困擾著廣大女性患者[9]?，F(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥治療PCOS較西藥治療療效更顯著，且毒副作用較小。PCOS屬于中醫(yī)學(xué)“不孕”“月經(jīng)稀少”“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“癥瘕”“崩漏”等范疇[10]。劉云鵬行醫(yī)濟(jì)世80余年，對(duì)婦科有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為腎虛是PCOS的根本病機(jī)[11]。通過長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，脾腎陽虛夾痰濕型的PCOS患者居多，然而運(yùn)用常規(guī)的溫補(bǔ)腎陽配伍化痰藥物組方治療臨床療效并不太理想。經(jīng)過長期臨床實(shí)踐，師法仲景自創(chuàng)溫陽化痰湯。該方以附子-半夏共為君藥，辛開燥降，相輔相成，散臟腑經(jīng)絡(luò)、肌表上下的痰飲停滯，使陰寒得散、脾腎得溫、水濕得化、痰飲得消，則陽虛痰濁諸癥自除。該方雖含有反藥組合附子-半夏，但療效顯著并無不良反應(yīng)出現(xiàn)，提示二者同用“相反”不是絕對(duì)禁忌。

CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN和CR是目前診斷心臟、肝臟、腎臟疾病較常用的指標(biāo)，其在血液中的含量可客觀反映各臟器細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度，對(duì)于臨床診斷具有重要的參考意義[12-14]。在本實(shí)驗(yàn)中，由血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠各指標(biāo)水平均高于正常大鼠，表明PCOS對(duì)大鼠的心、肝、腎造成損傷，特別是對(duì)心和肝的損傷較嚴(yán)重；與模型組比較，附子-半夏PCOS組大鼠各指標(biāo)水平顯著升高，表明附子-半夏反藥組合會(huì)進(jìn)一步損傷心、肝、腎；與模型組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠各指標(biāo)水平降低，表明溫陽化痰湯可通過降低血清酶水平起到保護(hù)PCOS大鼠臟器的作用，同時(shí)也說明附子-半夏反藥組合經(jīng)配伍后對(duì)PCOS大鼠臟器的損害程度減弱；與正常組比較，溫陽化痰湯正常組大鼠各指標(biāo)水平升高，表明其可造成正常大鼠的臟器損傷。

經(jīng)過顯微病理學(xué)觀察分析發(fā)現(xiàn)，與溫陽化痰湯PCOS組大鼠比較，附子-半夏PCOS組大鼠的心臟、肝臟和腎臟形態(tài)學(xué)均可見明顯的變化；與PCOS大鼠比較，正常大鼠經(jīng)溫陽化痰湯干預(yù)后，其心臟和肝臟形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，均可見不同程度的損傷，腎

臟形態(tài)學(xué)改變不明顯。結(jié)果表明，附子-半夏反藥組合可嚴(yán)重?fù)p傷PCOS大鼠的臟器組織，但在復(fù)方中經(jīng)配伍后對(duì)臟器的損害程度明顯減弱；溫陽化痰湯對(duì)正常大鼠的臟器組織可造成明顯損傷，特別是對(duì)心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞，但可緩解PCOS大鼠各臟器組織的病理變化；組織病理學(xué)的結(jié)果與血液生化指標(biāo)的檢測結(jié)果基本一致。

綜上所述，在病理?xiàng)l件下附子-半夏反藥組合在溫陽化痰湯中的毒性降低；溫陽化痰湯對(duì)PCOS大鼠未見明顯毒性，對(duì)正常大鼠的毒性明顯高于PCOS大鼠。由此可見，附子-半夏反藥組合在復(fù)方中經(jīng)配伍后其毒性會(huì)降低，體現(xiàn)了中藥配伍減毒的特點(diǎn)；同時(shí)，溫陽化痰湯的毒性在生理和病理狀態(tài)下的動(dòng)物中表現(xiàn)出較大差異，體現(xiàn)了明代著名醫(yī)家張景岳在注釋《素問·六元正紀(jì)大論篇》中提到的“有病則病受之”[15]的觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在特定的病理?xiàng)l件下，附子-半夏反藥組合在一段時(shí)間內(nèi)、一定劑量范圍內(nèi)可與其他中藥組成方劑使用。