人牙齦成纖維細(xì)胞在聚醚醚酮片和純鈦片表面的體外生物相容性比較*

于世德，黎日照，伍思俊，張 鵬，呂炳輝，喬建勛，顏 丹，羅湧彬

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·佛山市口腔醫(yī)院，佛山 528000

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）是一種由羰基和醚基連接芳香環(huán)組成新型的半結(jié)晶性的全芳香族高分子聚合物［1］。由于其耐高溫、耐腐蝕、耐磨、耐疲勞、阻燃以及絕緣等優(yōu)異性能，同時(shí)還具有耐摩擦性、耐藥品性、耐水分解性以及優(yōu)良的生物相容性，PEEK 材料獲得了廣泛的應(yīng)用［2-4］。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為性能優(yōu)異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應(yīng)用在了顱面部骨缺損的修復(fù)上［5］。聚醚醚酮具有良好的生物相容性已經(jīng)與骨具有相近的彈性模量，近年來在口腔領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［5-6］。在口腔種植領(lǐng)域，相比傳統(tǒng)金屬材質(zhì)的口腔種植愈合基臺(tái)，由聚醚醚酮材料制作的愈合基臺(tái)具有較好的生物相容性以及更大的可調(diào)改空間，更有利于種植體后期的美學(xué)修復(fù)。

相比于傳統(tǒng)的金屬及合金生物材料，PEEK 在骨科領(lǐng)域具有更加巨大的臨床應(yīng)用前景［6］。 然而，關(guān)于PEEK 材料對于軟組織修復(fù)應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道較少。因此，對于PEEK 材料在軟組織修復(fù)方面的研究能夠?yàn)槿蘸笃渑R床廣泛應(yīng)用，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究擬采用牙齦成纖維細(xì)胞與PEEK 以及Ti 片共培養(yǎng)后，比較兩種材料對于牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、增殖能力進(jìn)行探究，為日后PEEK 材料應(yīng)用于種植體基臺(tái)材料對于軟組織修復(fù)能力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。拓展了聚醚醚酮材料在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，還為種植修復(fù)技術(shù)提供了新的方向和選擇，對于口腔種植學(xué)和口腔材料學(xué)提供重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

聚醚醚酮（廣東粵誠牙科技術(shù)開發(fā)有限公司），鈦（廣東粵誠牙科技術(shù)開發(fā)有限公司），掃描電子顯微鏡S-3000N（Hitachi，日本），CCK-8(東仁，日本)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀Infinite200（Tecan 公司，瑞士），細(xì)胞死活染色試劑盒（碧云天，中國），羅丹明鬼筆環(huán)肽（索萊寶，中國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

牙齦成纖維細(xì)胞取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25 周歲阻生牙拔除患者正常牙齦組織。使用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞，10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長至覆蓋瓶底的80%時(shí)，細(xì)胞接種于各個(gè)試件表面接種密度為1 × 105個(gè)/mL。

1.3 試件制備

將直徑為10.0 mm的PEEK和Ti制備成厚度為1.0 mm、直徑為10 mm 的圓片狀PEEK 試件和Ti 試件，用400#、500#、600#、1000#、2000#的碳化硅砂紙逐級打磨拋光。依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗10 min，60 ℃水浴酸蝕30 min，乙醇浸泡紫外照射消毒滅菌后干燥備用，見圖1。

圖1 PEEK試件和Ti試件實(shí)物圖

1.4 掃描電鏡觀察細(xì)胞的黏附形態(tài)

PEEK 組和Ti 組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)試件。將牙齦成纖維細(xì)胞按照相同密度（1 × 105 個(gè)/mL）， 接種于各試件表面， 分別于24 h 終止培養(yǎng)， 掃描電鏡觀察試件表面細(xì)胞形態(tài)。

1.5 死活細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞死亡

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105 個(gè)/mL 的密度接種于試件表面牙齦成纖維細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育6 h，12 h，24 h 后，吸除培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入250 μL細(xì)胞死活染色工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育30 min，正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 CCK-8方法檢測細(xì)胞的增殖能力

PEEK 組和Ti 組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)置3 個(gè)平行試件，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置空白孔和背景孔。將牙齦成纖維細(xì)胞按照1 × 105個(gè)/mL密度接種于各試件表面，分別于6 h、12 h、24 h 終止培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)基，按每孔500 μL體積配置實(shí)驗(yàn)所需CCK-8工作液，將各試件置于CCK-8 溶液中，避光孵育1 h～4 h，吸取100 μL混合液至96 孔板中，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長下檢測樣本的吸光度值。

1.7 羅丹明鬼筆環(huán)肽染色檢測細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞按照1 × 105個(gè)/mL密度接種于各試件表面，培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min； PBS洗滌3次，每次5 min，5 μg/mL的羅丹明鬼筆環(huán)肽室溫避光染色40 min，PBS 漂洗3 次，DAPI復(fù)染。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism8 軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對于兩組獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷；數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，但方差不齊，采用校正的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察試件表面形貌

掃描電鏡觀察Ti 試件及PEEK 表面形貌，結(jié)果顯示試件經(jīng)過打磨酸蝕后表面呈不規(guī)則形，試件表面不平整。PEEK 試件表面呈不規(guī)則片層狀結(jié)構(gòu)，Ti 試件表面呈蜂窩狀孔隙結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察PEEK及Ti表面形貌

2.2 掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附形態(tài)

掃描電鏡觀察牙齦成纖維細(xì)胞在Ti 試件及PEEK 表面黏附情況。分別將牙齦成纖維細(xì)胞接種于滅菌后的Ti試件及PEEK 試件表面24 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)及黏附水平，結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在細(xì)胞在PEEK 試件表面的黏附數(shù)量要多于Ti 試件表面。觀察牙齦成纖維細(xì)胞黏附形態(tài)，結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面及Ti 試件表面成長梭形，形態(tài)不規(guī)則，呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面伸出較多絲狀偽足及蛋白纖維絲，且在PEEK 試件表面鋪展更開。結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件和Ti試件表面均可黏附與增殖，且在PEEK表面細(xì)胞黏附要優(yōu)于Ti表面，見圖3。

圖3 牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面黏附情況

2.3 細(xì)胞死活染色

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度接種于試件表面，分別培養(yǎng)6 h，12 h，24 h 后進(jìn)行Calcein-AM/PI免疫熒光染色。熒光正置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示Ti試件表面較PEEK 試件表面在6 h，12 h，24 h均出現(xiàn)了較多PI染色的死細(xì)胞，而PEEK 試件表面未見明顯PI 染色的死細(xì)胞，且活細(xì)胞多于Ti試件組，見圖4。

圖4 齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞死活染色

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將PEEK 試件，Ti 試件分別與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，12 h，24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖水平。結(jié)果顯示PEEK 試件，Ti 試件與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后，PEEK 試件表面細(xì)胞增殖能力均優(yōu)于Ti 試件組；隨著共培養(yǎng)時(shí)間增長，細(xì)胞增殖增加。即牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面培養(yǎng)6 h、12 h、24 h的活細(xì)胞數(shù)均高于Ti試件組，見圖5。

2.5 細(xì)胞黏附檢測

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105 個(gè)/mL 的密度接種于試件表面，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后進(jìn)行羅丹明鬼筆環(huán)肽熒光染色，檢測細(xì)胞的形態(tài)以及黏附于材料表面情況。結(jié)果顯示細(xì)胞接種6 h、12 h、24 h，牙齦成纖維細(xì)胞均可黏附于試件表面，而在PEEK 試件表面細(xì)胞黏附效果更佳，細(xì)胞鋪展更開，伸出更多偽足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEEK 較Ti更有利于黏附細(xì)胞的伸展，見圖6。

圖5 材料與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖性能測定，*表示P＜0.05

圖6 牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞黏附形態(tài)檢測

3 討論

隨著口腔技術(shù)的不斷發(fā)展, 各種材料被應(yīng)用于種植體穿齦部分的研發(fā)。PEEK 是一種具有良好生物性能的高分子材料，在骨修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用，研究表明PEEK 的機(jī)械性能優(yōu)于現(xiàn)有的牙科金屬材料，并且與骨具有相近的彈性模量［7］。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為性能優(yōu)異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應(yīng)用在了顱面部骨缺損的修復(fù)上。近年來在口腔種植領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用［6,8］。牙種植體材料是否具有良好的細(xì)胞黏附增殖性能，是評價(jià)其生物學(xué)性能的重要指標(biāo)之一［9-10］。種植體植入種植窩內(nèi)，種植窩周圍血液中蛋白能夠迅速吸附在種植體表面，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附于種植體表面，為之后的愈合發(fā)揮重要作用［11］。越來越多的研究關(guān)注種植體表面軟組織的修復(fù)。但是其對于軟組織的修復(fù)能力的相關(guān)研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對PEEK 及傳統(tǒng)種植基臺(tái)材料Ti 進(jìn)行了體外細(xì)胞生物相容性的比較，通過牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 及Ti材料表面的黏附、增殖能力評價(jià)PEEK 的細(xì)胞生物相容性，探討PEEK 作為牙種植基臺(tái)新材料的可能性。

本實(shí)驗(yàn)制備PEEK 和Ti 標(biāo)準(zhǔn)化試件，經(jīng)過粗糙度不同的碳化硅砂紙打磨后，經(jīng)過酸蝕，清洗，殺菌后，使用掃描電子顯微鏡觀察試件表面形貌。通過分別將牙齦成纖維細(xì)胞接種于PEEK 及Ti 試件表面共培養(yǎng)6 h、12 h、24h 后利用掃描電子顯微鏡，CCK-8及免疫熒光檢測細(xì)胞的增殖及黏附性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過打磨酸蝕殺菌后的PEEK 表面呈片層狀，不規(guī)則粗糙的形貌，而Ti 試件表面表面呈蜂窩狀多孔粗糙形貌。將牙齦成纖維細(xì)胞接種于試件表面24 h 后，掃描電鏡觀察顯示，牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 表面和Ti 表面均可黏附生長，但在PEEK 試件表面較Ti試件表面細(xì)胞鋪展更開，伸出更多的纖毛和偽足。說明牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 表面黏附性更好。CCK-8 檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將牙齦成纖維細(xì)胞接種于試件表面培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后，細(xì)胞在PEEK 表面細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，在6 h、12 h、24 h 細(xì)胞增殖能力均強(qiáng)于Ti 試件組。活細(xì)胞死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，細(xì)胞接種于PEEK 表面6 h、12 h、24 h 后，試件表面均沒有出現(xiàn)明顯的PI染色的死細(xì)胞，而在Ti表面出現(xiàn)了少量PI染色的死細(xì)胞，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，死細(xì)胞染色增多。羅丹明鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果同樣顯示，牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面鋪展更開，細(xì)胞形態(tài)更長，伸出偽足更多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果一致。

理想的種植體材料應(yīng)該具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和黏附。PEEK 作為一種具有優(yōu)良理化特性的生物醫(yī)學(xué)高分子材料，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景［12］。本實(shí)驗(yàn)通過比較PEEK 及Ti對于牙齦成纖維細(xì)胞的增殖黏附能力，驗(yàn)證PEEK 的體外生物相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEEK和Ti相比具有更好的生物相容性，能夠在體外促進(jìn)牙齦成纖維的黏附增殖。但是有實(shí)驗(yàn)表明PEEK由于過于穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得其具有明顯的惰性及疏水性［4］，嚴(yán)重限制了其生物學(xué)應(yīng)用。因此更多關(guān)于PEEK 及其改性的相關(guān)研究仍需進(jìn)行，為下一步的臨床應(yīng)用提供依據(jù)和參考。