CDK4、CyclinD1、P16在肺小細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳 威，譚敏華，黃文彥，周泳健，歐瑞芬

肇慶市第一人民醫(yī)院病理科，廣東 肇慶 526000

肺小細(xì)胞癌（Small cell lung cancer, SCLC）是一種惡性腫瘤疾病，該病的疾病進(jìn)展快且自然病程短［1］。針對(duì)SCLC 這一類型的疾病，盡早的診斷疾病具有重要意義。關(guān)于SCLC 的診斷，研究表明對(duì)癌基因進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 蛋白均是引起肺癌發(fā)生的主要基因產(chǎn)物，通過對(duì)上述三種基因產(chǎn)物進(jìn)行檢查，對(duì)在其檢出SCLC有重要意義［2］。SCLC有明顯的神經(jīng)內(nèi)分泌分化特征，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，其中CgA、CD56、Syn等是常見的神經(jīng)內(nèi)分泌抗體，在SCLC等神經(jīng)內(nèi)分泌分化性腫瘤的病理診斷中有著十分重要的作用。本次研究中，就具體探討了在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表達(dá)情況，以為疾病的早期診斷及治療提供滿意參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究中選取2010 年8 月—2019 年12 月收治的80例SCLC 患者為研究對(duì)象，35 例非肺癌組織為對(duì)照。肺癌病理組織均參照世界衛(wèi)生組織中的腫瘤分型，均是穿刺活檢組織病例。80 例SCLC 的基本資料如下：男性63 例，女性17例；年齡39～86歲，平均年齡（63.2±2.3）歲。35例非肺癌組織材料均選取自肺大皰、肺出血的患者。

1.2 檢測(cè)方法

采取免疫組化進(jìn)行標(biāo)本的染色，操作步驟主要如下：（1）對(duì)于穿刺活檢病理切片組織，均應(yīng)用福爾馬林進(jìn)行固定并且使用石蠟進(jìn)行包埋，將組織切片制成5 μm的切片，用二甲苯進(jìn)行脫蠟，每次10 min，總共兩次，用100%、95%、80%、70%不同梯度的乙醇進(jìn)行水化，每一個(gè)梯度的水化時(shí)間均為5 min，蒸餾并且使用水洗5 min 每次，持續(xù)水洗兩次。（2）配制新鮮的濃度為3%的過氧化氫溶液，使用這一溶液來封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性，在室溫下放置15 min后用蒸餾水水洗5 min。（3）組織切片置入搭配0.01M 的枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中，修復(fù)液的PH 值為6.0，使用高壓進(jìn)行抗原修復(fù)3 min，取出后冷卻到室溫下取出組織切片。（4）使用濃度為5%的非免疫羊血清，在37 ℃的溫度下孵育20 min，封閉以免發(fā)生非特異性抗原反應(yīng)。（5）使用濾紙將多余的血清吸除，加入第一個(gè)抗體在玻片上，P16作為第一抗體，將該抗體放在4 ℃的冰箱過夜，CDK4、CyclinD1 一抗則置入37 ℃的環(huán)境中孵育120 min，PBS洗5 min，總共3次。（6）加入生物素標(biāo)記二抗，比值1:200，抗體置入到37 ℃的環(huán)境中30 min，PBS 洗5 min。持續(xù)3次。（7）加入經(jīng)標(biāo)記后的過氧化酶的鏈酶索-親和素復(fù)合物（1∶150），在37 ℃的環(huán)境下放置30 min，PBS 洗5 min，持續(xù)3 次。（8）新鮮配備的DAB 于顯微鏡下檢測(cè)進(jìn)行顯色，在合適的時(shí)間停止進(jìn)行顯色，顯色后使用自來水進(jìn)行沖洗。（9）應(yīng)用Harris蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，應(yīng)用1%的鹽酸酒精進(jìn)行分化，之后充分進(jìn)行水洗以返藍(lán)，在梯度酒精下充分脫水，之后用樹膠進(jìn)行封片。

1.3 觀察指標(biāo)

以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色的免疫沉積物判定呈陽性，借助雙盲法，計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍視野，按照切片中陽性細(xì)胞比作，觀察同種類型細(xì)胞數(shù)所占百分比及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度。依據(jù)切片陽性細(xì)胞占據(jù)觀察的同類細(xì)胞數(shù)百分比、陽性細(xì)胞著色強(qiáng)的指標(biāo)，以切片中陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)具體如下：小于5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2分，大于51%為3分。顯色程度判斷陽性強(qiáng)度，基本不著色為0分，著色呈淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3 分。每張切片著色程度得分同著色細(xì)胞百分比相乘，其中0～1 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～6 分為中等陽性（++），6 分以上為強(qiáng)陽性（+++），弱陽性也納入陽性判定中。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0 軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCLC與正常組織CDK4、CyclinD1、P16的比較

三種蛋白行免疫組化染色，在CDK4、CyclinD1、P16檢出的陽性率上NSCLC組織要明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 CDK4、CyclinD1、P16蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果 例（%）

2.2 SCLC 患者中CgA、CD56、Syn 等神經(jīng)內(nèi)分泌抗體的表達(dá)

CgA、CD56、Syn的陽性表達(dá)情況，見表2。

表2 SCLC患者中CgA、CD56、Syn等神經(jīng)內(nèi)分泌抗體的表達(dá) 例（%）

2.3 CDK4、CyclinD1、P16表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌表達(dá)相關(guān)性

CDK4、CyclinD1 與CgA、CD56、Syn 表達(dá)呈正相關(guān)（P＞0.05），P16 表達(dá)與CgA、CD56、Syn 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 CDK4、CyclinD1、P16表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌表達(dá)相關(guān)性

3 討論

SCLC 是起源于支氣管黏膜或腺體的肺癌疾病，該疾病的致死率非常高，因此早期診斷疾病非常關(guān)鍵［3］。對(duì)SCLC 疾病，穿刺活檢組織病理學(xué)檢查一直都是臨床診斷疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，而一般進(jìn)行這種檢測(cè)的時(shí)候，患者也常會(huì)出現(xiàn)典型的表現(xiàn)，且確診患者也多處在肺癌中晚期階段［4］。為了提高肺癌的早期檢出率，需要探討更加有效的檢測(cè)手段。

對(duì)于SCLC，研究表明此類患者CDK4、CyclinD1、P16 表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)明顯的改變，因此對(duì)這幾種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)也就成為了SCLC 檢測(cè)的一種新的手段［5］。CDK 屬于周期蛋白依賴性蛋白激酶，該物質(zhì)可以通過對(duì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學(xué)作用來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期，這屬于細(xì)胞周期中的重要調(diào)控因子［6］。CDK 活性依賴正調(diào)節(jié)亞基Cyclin 順序性表法及負(fù)調(diào)節(jié)亞基，且該物質(zhì)的活性還受磷酸化與去磷酸化，對(duì)癌基因及抑癌基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，CDK家族包括1～8種亞型，CDK4 為其中的一種亞型。CyclinD1 主要為細(xì)胞周期素D1，細(xì)胞周期為連續(xù)性過程，而其中部分時(shí)間限制點(diǎn)對(duì)多個(gè)控制細(xì)胞周期的進(jìn)程有滿意的調(diào)節(jié)作用，CyclinD1 在細(xì)胞周期中，同特異CDK 形成復(fù)合物，這樣可以調(diào)節(jié)CDK 的活性，且CyclinD1復(fù)合物也可同pRb蛋白進(jìn)行結(jié)合，一同在癌細(xì)胞周期中發(fā)揮作用［7］。P16 是腫瘤細(xì)胞中常見的抑基因，這一蛋白屬于細(xì)胞周期素依賴激酶抑制物，可同CyclinD1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合為CDK4，P16 同CDK4 進(jìn)行稽核，會(huì)使CDK4 的活性受有效抑制，使得CDK4 無法解除pRb 蛋白對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的抑制，這樣可組織細(xì)胞的生長(zhǎng)及分裂［8］。在正常的情況下，機(jī)體組織中的CDK4、CyclinD1、P16 不表達(dá)，而在發(fā)生癌變后這些物質(zhì)就會(huì)出現(xiàn)表達(dá)異常的情況，且隨著癌癥的持續(xù)進(jìn)展，表達(dá)水平也會(huì)持續(xù)升高，這為SCLC 的早期檢出提供有利幫助。在本次研究中，選取了SCLC 患者組織及非肺癌患者組織進(jìn)行了染色及檢測(cè)，結(jié)果顯示在對(duì)CDK4、CyclinD1、P16 各物質(zhì)檢出陽性情況上， SCLC 檢出各物質(zhì)的陽性率上要顯著高于正常組織。而作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，CDK4、CyclinD1、P16 與其常見的神經(jīng)內(nèi)分泌分化腫瘤標(biāo)志物CgA、CD56、Syn 等有何關(guān)系，是將來臨床SCLC 早期診斷研究的一個(gè)方向，對(duì)該病的診斷檢查有十分重要的意義。分析CDK4、CyclinD1、P16 與神經(jīng)內(nèi)分泌抗體的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CDK4、CyclinD1 與CgA、CD56、Syn 表達(dá)呈正相關(guān)，P16表達(dá)與CgA、CD56、Syn 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這能夠?yàn)榕R床SCLC的早期診斷提供新的有利參考。

綜上所述，相較于正常的機(jī)體組織，在SCLC 患者中，CDK4、CyclinD1、P16 的表達(dá)水平高，在進(jìn)行肺癌的診斷過程，采取免疫組化染色及檢測(cè)以上三種物質(zhì)的方式，可以為SCLC 的早期診斷提供有利的幫助，進(jìn)而為其治療提供參考，因此值得在臨床中推廣使用。