HPLC 法同時(shí)測(cè)定參苓護(hù)肝膠囊中4 種成分的含量

段立廣 閆 凱

（1、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 石家莊050000 2、河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院化學(xué)藥品檢驗(yàn)室，河北 石家莊050000）

參苓護(hù)肝膠囊是由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院制劑室研制生產(chǎn)的復(fù)方制劑，由黨參、白術(shù)、茯苓、柴胡、木香、厚樸、當(dāng)歸、白芍、赤芍、法半夏、郁金、甘草12 味藥組成，具有健脾益氣疏肝、保肝護(hù)肝、保肝康復(fù)等功效[1-4]。該復(fù)方成分組成復(fù)雜，作為院內(nèi)制劑內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)茯苓、白術(shù)、芍藥進(jìn)行了定性鑒別，尚無主要成分的含量測(cè)定。為全面提高參苓護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制水平，保證人民用藥的有效性和安全性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯等4 種成分含量的方法，簡(jiǎn)便快速，為更有效的控制參苓護(hù)肝膠囊的質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品: 芍藥苷（批號(hào)110736-201438）、厚樸酚（批號(hào)110729-201513）、和厚樸酚（批110730-201614）、木香烴內(nèi)酯(批號(hào)111524-201509) 對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，參苓護(hù)肝膠囊樣品來自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、為優(yōu)級(jí)純；水為超純水。儀器:高效液相色譜儀（Agilent 1260，配備PDA 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；純水儀（Millipore 公司）；超聲儀（KQ-500KDE，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱:Thermo Accliam（5?m，4.6mm×250mm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫: 0～11min，7%→12% A；11～20min，12%→34% A；流速為1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):230nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量: 10μL。

1.3 溶液的配制

供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理40 分鐘（功率400W，頻率40kHz)，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇適量超聲溶解并稀釋制成含芍藥苷0.785mg/ml、厚樸酚0.201mg/ml、和厚樸酚0.9232mg/ml、木香烴內(nèi)酯0.278mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯儲(chǔ)備液各2.0ml，2.0ml ，1.0ml ，20.0ml，置于同一50ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

1.4 方法學(xué)考察

專屬性:考察色譜條件下，待測(cè)物質(zhì)分離情況，以及待測(cè)樣品和陰性樣品中其他物質(zhì)對(duì)待測(cè)成分的影響。線性關(guān)系:分別精密稱取芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，配置成系列濃度的對(duì)照品溶液，分別吸取10μl，注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。儀器精密度:精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積。重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)：16081089），研細(xì)，分別稱取0.25 g、0.5g、0.75g 各三份，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備9 份供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯的平均含量及RSD。穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液（批號(hào)：16081089），于0 小時(shí)開始測(cè)定，以后分別在3,6,12,15,20,24 小時(shí)測(cè)定一次，記錄峰面積。加樣回收試驗(yàn):采用加樣回收測(cè)定法。取已知含量的樣品（批號(hào)：16081089 含量見重復(fù)性結(jié)果），研細(xì)，取9 份，每份約0.25g，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入用溶液配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯加樣回收率(n=9)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

專屬性:在上述色譜方法條件下，各待測(cè)成分分離良好，樣品中其他成分不干擾測(cè)定，色譜圖見圖1。線性關(guān)系:四種待測(cè)成分線性關(guān)系良好,結(jié)果見表1。儀器精密度:4 種成分峰面積RSD 分別為0.2%，0.1%，0.1%，0.2%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn):芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯的平均含量(n=9)分別為3.4475mg/g，0.6750mg/g，0.9019mg/g，0.3481mg/g，RSD 分 別 為2.5%、1.9%、2.8%、2.2%，表明該方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn):芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯RSD 分別為1.7%、1.1%、2.2%、0.1%，表明供試品溶液至少在24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收試驗(yàn):芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯加樣回收率(n=9) 分別為102.4% (RSD =2.3%)，100.2% (RSD =2.2%)，101.8% (RSD =2.5%)，104.0% (RSD =2.5%)。結(jié)果見表2，表明本方法回收率良好。

圖1 混合對(duì)照品（A）、樣品（B）和陰性樣品（C）的液相色譜圖（和厚樸酚（1）、芍藥苷（2）、木香烴內(nèi)酯（3）、厚樸酚（4））

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 樣品分析

取3 批樣品，每批次平行2 份，分別按“1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，再用外標(biāo)法分別計(jì)算芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯的含量。計(jì)算芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中5 種成分含量（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用甲醇、70%甲醇、50%甲醇3 種不同提取溶劑，超聲、回流等不同的提取方法考察含量，結(jié)果采用甲醇超聲提取更完全，且操作簡(jiǎn)單、快捷。

樣品處方中藥味多，成分復(fù)雜，雜質(zhì)多，性質(zhì)相近的成分多，在流動(dòng)相的選擇中，分別嘗試了乙腈-0.3%三乙胺（磷酸調(diào)pH值2.5），乙腈-0.2%磷酸，乙腈-0.02mol/L 的磷酸二氫鉀等不同的流動(dòng)相體系，最終采用乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，可以使4 種成分完全分離，且峰形對(duì)稱。

在測(cè)定波長(zhǎng)的選擇中，厚樸酚與和厚樸酚在210nm 波長(zhǎng)附近未端有最大吸收[5]，木香羥內(nèi)酯在220nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收[6]，芍藥苷在230nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收[7]。在200～220nm 波長(zhǎng)下，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果待測(cè)成分與雜質(zhì)峰分離較差，因此選用待測(cè)成分響應(yīng)較強(qiáng)且無雜質(zhì)峰干擾的230nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)下所有成分均有較高的靈敏度，且各待測(cè)成分與雜質(zhì)峰分離良好，陰性無干擾。

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC 方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)參苓護(hù)肝膠囊中芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯含量的同時(shí)測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，快速環(huán)保，專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等良好，可作為參苓護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制方法。