基于GEO數(shù)據(jù)庫探索成釉細胞瘤與牙源性角化囊腫間差異基因

蘭天俊，劉 鑫，陳之鋒

成釉細胞瘤(ameloblastoma, AM)是一種口腔頜面部常見的牙源性良性頜骨腫瘤，來源于釉質(zhì)器或者牙板上皮，常常表現(xiàn)為初期無自覺感覺的緩慢生長，逐漸向周圍膨脹，導致頜骨膨大，造成頜面部畸形[1-3]。臨床發(fā)現(xiàn)成釉細胞瘤具有局部侵襲性、術后高復發(fā)率以及偶見遠處轉移等特點，故又被稱為“臨界瘤”。牙源性角化囊腫(odontogenic keratocyst, OKC)是一種口腔頜面部常見的牙源性囊腫，來源于原始的牙胚或牙板殘余，也是在發(fā)病初期無明顯癥狀的緩慢生長，逐漸增大，最終導致一系列癥狀[3-4]。因其組織表現(xiàn)為不全角化的復層鱗狀上皮，并具有浸潤性生長和局部復發(fā)的生物學行為，曾一度被國內(nèi)外學者認為是牙源性腫瘤，2017版WHO牙源性腫瘤新分類中將其重新歸為牙源性囊腫[1,3,5]。臨床診療中，往往需要將成釉細胞瘤與牙源性角化囊腫進行鑒別診斷，兩者在臨床表現(xiàn)及影像學表現(xiàn)上存在一定的相似性，并且角化囊腫能轉變?yōu)榛蛲瑫r伴有成釉細胞瘤，導致診斷難度增大。另外根據(jù)口腔頜面功能外科的要求，由于角化囊腫并非良性腫瘤，臨床治療可偏向相對保守的治療。因此尋找兩者間的特異性標志物不僅有助于精準診斷，還有助于精準治療。此外通過尋找兩者之間的差異基因，篩選出與成釉細胞瘤侵襲生長相關的標志物，可為臨床治療成釉細胞瘤和牙源性角化囊腫提供新的思路。

目前對于成釉細胞瘤和牙源性角化囊腫的發(fā)病和術后復發(fā)機制尚未明確。既往有研究發(fā)現(xiàn)BRAF V600E在含成釉細胞的牙源性腫瘤中特異性高表達，認為其是成釉細胞瘤的特異性分子標志物[6-7]。Kaye等[8]認為BRAF V600E有希望成為治療成釉細胞瘤的靶點。他們對1例肺轉移的成釉細胞瘤患者使用BRAF V600E突變的靶向藥物20周后，口腔原發(fā)灶與肺轉移瘤體明顯縮小。但是由于角化囊腫存在轉變?yōu)榛虬橛谐捎约毎龅默F(xiàn)象，這對臨床運用BRAF V600E診斷造成了一定困難。而對于牙源性角化囊腫，抑癌基因PTCH的突變過去被認為是在牙源性角化囊腫中特異性表達，隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)，PTCH突變多見于痣樣基底細胞癌綜合癥患者，在散發(fā)的牙源性角化囊腫患者中并不多見[6,9]。目前還未有一個明確的特異性標志物來進行兩者的診斷。

生物信息學是近年來迅速發(fā)展起來的在生命科學的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的一門新興學科，其研究重點是基因組學和蛋白質(zhì)組學。在腫瘤領域，生物信息學分析已經(jīng)得到了廣泛的運用，通過高通量的運算來獲得大量的基因表達信息，進而鑒定其中的遺傳變異，并探索與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的基因變化。近年來越來越多的學者運用生物信息學分析來探究各種癌癥的表達差異基因，并研究這些基因在分子功能、細胞組成以及生物過程中所發(fā)揮的作用[10-11]。

為此，我們從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出成釉細胞瘤和牙源性角化囊腫間的差異基因(different expression genes, DEGs)，并對這些差異基因進行基因本體論分析(Gene Oncology, GO)和京都基因和基因組百科全書分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，之后構建蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-protein interaction, PPI)進一步篩選出核心功能基因(hub genes)。

1 資料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)來源

本研究所使用的芯片數(shù)據(jù)GSE38494[12]來自于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed),使用GPL570平臺(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，包含15個成釉細胞瘤組織樣本，12個散發(fā)牙源性角化囊腫組織樣本，1個痣樣基底細胞癌綜合癥患者組織樣本，1個成釉細胞纖維牙瘤組織樣本，4個正常組織樣本和2個口腔鱗狀細胞癌組織樣本。在本研究中，我們選取了其中的15個成釉細胞瘤組織樣本和12個散發(fā)牙源性角化囊腫組織樣本。

1.2 差異基因分析

使用R軟件讀取上述27個組織樣本基因芯片數(shù)據(jù)，使用LIMMA數(shù)據(jù)分析包進行差異基因分析[13]。將成釉細胞瘤組作為實驗組，牙源性角化囊腫組作為對照組，以P<0.01和差異倍數(shù)log FC>2作為篩選條件來選取差異基因。

1.3 GO分析和KEGG分析

在線分析工具DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)對所獲得的差異基因進行GO分析和KEGG分析，并以篩選條件為P<0.01選出顯著富集結果[14]。

1.4 PPI網(wǎng)絡構建

我們使用交互基因檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING)網(wǎng)站(http://string-db.org)構建差異基因PPI網(wǎng)絡[15]。之后Cytoscape軟件進行結果可視化，并使用MCODE插件篩選其中的關鍵基因(Hub genes)[16]。GenCLiP2數(shù)據(jù)庫用來進一步富集Hub基因功能,篩選條件為P<1×10-4[17]。

2 結 果

2.1 差異表達基因

首先，我們對27個樣本進行了主成分分析，具體結果見圖1。結果顯示成釉細胞瘤與牙源性角化囊腫間基因表達存在明顯差異。

紅色：牙源性角化囊腫；綠色：成釉細胞瘤圖1 成釉細胞瘤樣本與牙源性角化囊腫樣本間的主成分分析Fig.1 Principal component analysis between ameloblastoma and odontogenic keratocyst samples

之后我們通過LIMMA包進行成釉細胞瘤對比牙源性角化囊腫的差異基因篩選，獲得了335個差異基因，并將相應結果用下表展示(表1)。

表1 成釉細胞瘤與牙源性角化囊腫間的335個差異基因Tab.1 355 DEGs between ameloblastoma and odontogenic keratocyst

2.2 差異基因的GO分析及KEGG分析

利用DIVID 6.8分別對335個差異基因做GO分析及KEGG分析。

2.2.1 GO分析結果 335個差異基因富集的GO條目有216條，以P<0.01作為篩選條件，56條顯著富集通路被選出，其中39條(69.6%)富集在生物過程，包括神經(jīng)元分化、細胞粘附、生物粘附、與分化有關的細胞形態(tài)發(fā)生、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞命運鎖定等；14條(25.0%)富集在細胞組成，包括細胞外區(qū)、細胞外基質(zhì)、細胞外組分、蛋白質(zhì)類細胞外基質(zhì)、細胞外基質(zhì)結構的構成、突觸等；3條(5.4%)富集在分子功能，包括碳水化合物結合、肝素結合和轉錄因子活性。選取顯著富集生物過程、細胞組成和分子功能前6的條目，詳見表2。

表2 差異基因的GO富集分析結果Tab.2 GO enrichment analysis of DEGs

2.2.2 KEGG分析結果 335個差異基因富集到KEGG通路有11個，以P<0.01作為篩選條件，3條顯著富集通路被選取，包括細胞外基質(zhì)-受體相互作用、軸突導向和癌癥通路(表3)。

表3 差異基因的KEGG通路分析Tab.3 KEGG pathway analysis of DEGs

2.3 PPI網(wǎng)絡分析

將335個差異基因上傳至STRING網(wǎng)站進行蛋白相互作用分析，將結果導入Cytoscape軟件進行可視化(圖2)，并使用MCODE插件篩選出8個Hub基因，分別為：SPARCL1、SERPINA1、ITIH2、IGFBP5、LAMB1、C3、GOLM1、FAM20A(圖3)。將差異基因的Hub基因?qū)隚enCLiP2.0中進行功能富集，篩選條件為P<0.05，結果顯示Hub基因與細胞外基質(zhì)有關(圖4)。

圖2 差異基因的PPI蛋白互作網(wǎng)絡Fig.2 The PPI network of DEGs

圖3 Hub基因Fig.3 Hub genes

綠色：基因富集到的條目；黑色：基因未富集到的條目圖4 Hub基因的功能富集Fig.4 The function enrichment of Hub genes

3 討 論

在本研究中，我們將成釉細胞瘤作為實驗組，牙源性角化囊腫作為對照組，來探究兩者間的差異基因。通過對GEO數(shù)據(jù)的分析，335個差異基因被發(fā)現(xiàn)。之后對差異基因進行GO分析和KEGG分析。最后進行PPI蛋白互作網(wǎng)絡構建，并通過MCODE插件篩選出其中的Hub基因。一共有8個Hub基因被確定：SPARCL1、SERPINA1、ITIH2、IGFBP5、LAMB1、C3、GOLM1和FAM20A。

通過基因功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)相對于牙源性角化囊腫，成釉細胞瘤的335個差異基因的生物過程主要集中細胞自身這一方面，如細胞粘附、生物粘附、與分化有關的細胞形態(tài)發(fā)生、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞命運鎖定等；細胞組成集中在腫瘤微環(huán)境相關的條目，如細胞外區(qū)、細胞外基質(zhì)、細胞外組分、蛋白質(zhì)類細胞外基質(zhì)、細胞外基質(zhì)結構的構成等。另外KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集于細胞外基質(zhì)-受體相互作用和癌癥通路。這些結果與成釉細胞瘤的腫瘤臨床特性有關，也說明本研究所篩選的差異基因參與成釉細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程。

細胞外基質(zhì)是指由動物細胞分泌至細胞周圍的大分子物質(zhì)，主要由膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖與氨基聚糖這五種物質(zhì)組成，是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分[18]。有研究表明，細胞外基質(zhì)不僅僅只是在細胞間發(fā)揮惰性支持物的作用，還對細胞的功能、存活、增殖、分化和轉移等有調(diào)節(jié)作用。細胞外基質(zhì)能夠相互連接，構成復雜的網(wǎng)架結構來支持細胞結構，進而調(diào)節(jié)細胞的各項功能活動和組織的發(fā)生發(fā)展[19-21]。目前已經(jīng)證實細胞外基質(zhì)中的彈性纖維與一些普外科疾病如內(nèi)痔、腹股溝疝等的發(fā)生發(fā)展密切相關[22]。在腫瘤的侵襲轉移過程中，腫瘤細胞將細胞外基質(zhì)降解，進而突破細胞外基質(zhì)是其中非常關鍵的一環(huán)[23-24]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等可以降解細胞外基質(zhì)，在成釉細胞瘤中，MMP-2和MMP-9均有表達，這也一定程度上解釋了為什么成釉細胞瘤具有局部侵襲性、術后高復發(fā)率以及偶見遠處轉移等特點[25]。在本研究中，8個Hub基因有6個基因與細胞外基質(zhì)相關。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類似蛋白1(SPARCL1)是富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)家族成員，是一種小分子糖蛋白，參與胚胎發(fā)育、細胞發(fā)育與遷移和血管生成等生理過程[26]。研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤組織中，SPARCL1均有不同程度的表達[27-28]。Turtoi等[27]對腦膠質(zhì)瘤組織進行免疫組織化學檢查，發(fā)現(xiàn)SPARCL1在腦膠質(zhì)瘤中高表達，并與腫瘤的惡性程度呈正相關。而在乳腺癌中，與癌旁組織相比，SPARCL1在腫瘤組織呈低表達[28]。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(SERPINA1)，是一種血漿蛋白，主要在肝細胞中合成。由于其具有高度保守性，并且參與抑制血漿蛋白酶活性，被認為是一種抑癌基因[29-30]。目前已經(jīng)證實SERPINA1在多種癌癥組織中高表達[29-30]。人類中間胰蛋白酶抑制劑H2重鏈(ITIH2)，是血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一員，參與穩(wěn)定細胞外基質(zhì)和預防腫瘤轉移。其在正常乳腺、子宮、卵巢、肺和腎組織中均有表達，而在乳腺癌、肺癌、腎腫瘤、胃癌、直腸癌和前列腺癌中被發(fā)現(xiàn)表達下調(diào)[31]。胰島素樣生長因子結合蛋白-5(IGFBP5)屬于胰島素樣生長因子類(IGF)家族，在上皮生長過程中發(fā)揮著絲裂原和抗凋亡的作用，已知在多種腫瘤中有不同程度的表達，與腫瘤的生長相關[32]。目前發(fā)現(xiàn)IGFBP5在卵巢癌、宮頸癌、腦膜瘤等腫瘤中能夠起到抑癌作用[32]。層粘連蛋白β1(LAMB1)是細胞外基質(zhì)糖蛋白家族層粘連蛋白的一員，主要構成基底膜中的非膠原成分，參與細胞粘附、趨化、遷移、信號傳導等過程[33-34]。在腫瘤組織中，LAMB1作為67-kDa層粘連蛋白單體受體的配體在多種轉移性癌癥中高表達，并催動癌癥細胞的轉移、侵襲和血管生成[34]。補體系統(tǒng)是存在于血清中能夠輔助抗體所介導的溶菌作用的一組需經(jīng)活化后才具有酶活性的蛋白質(zhì)。補體成分C3是補體系統(tǒng)的中心分子，含量最高，也是啟動旁路途徑的關鍵分子[35]。在腫瘤患者中，補體量會升高，肝癌患者中C3含量升高最為明顯，被認為是診斷標志物[36]。高爾基體膜蛋白1(GOLM1)是一種上皮細胞特異性Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成后修飾，以及協(xié)助高爾基體完成蛋白轉運和分泌[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)GOLM1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌、肝癌、腎癌及肺癌等惡性腫瘤組織中顯著高表達，有望在未來成為早期診斷標志物[37-38]。序列相似家族20成員A(FAM20A)屬于FAM20(Family with Sequence Similarity 20)家族成員，是一種沒有激酶活性的假激酶，通過與FAM20C形成功能性復合物來激活其活性。目前已知FAM20A突變將導致釉質(zhì)發(fā)育不良、牙齦纖維瘤和釉腎綜合征[39]。迄今為止，上述8個Hub基因雖然在其他疾病得到不同程度的研究，但是在成釉細胞瘤中尚未研究它們在其發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。盡管如此，本研究的成果一定程度上能為成釉細胞瘤發(fā)生發(fā)展研究提供新的思路。

本研究運用生物信息學方法，篩選出了成釉細胞瘤和牙源性角化囊腫之間的差異基因，并對其功能進行了相關分析，雖然所篩選的基因目前并未被證實參與成釉細胞瘤發(fā)展過程，但是這也提示著這些基因可能是新的研究靶點，需要進一步的實驗驗證，同時也為成釉細胞瘤和牙源性角化囊腫的鑒別診斷提供了一些新的角度。