骨形態(tài)發(fā)生蛋白異源二聚體誘導(dǎo)成骨的研究新進展

周 健，涂業(yè)穎，趙子慕，黃必行，金佳楊，林海燕,2

Urist[1]于上世紀60年代將脫鈣骨基質(zhì)植入小鼠的肌肉或皮下，成功誘導(dǎo)異位成骨，由此推測存在一種誘導(dǎo)成骨因子，并于幾年后首次提出骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)[2]的概念。BMPs屬于TGF-β超家族成員，目前認為BMP除了具有骨誘導(dǎo)活性外，還在其他各器官的形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，因此也有研究者認為BMP應(yīng)當(dāng)被稱為“體形態(tài)發(fā)生蛋白”[3-4]。

幾乎所有BMP都形成同源二聚體或異源二聚體，且通常以同源二聚體的形式存在[5]。同源二聚體BMP-2和BMP-7經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準，已應(yīng)用于脊椎融合術(shù)、長骨缺損修復(fù)等治療，但其臨床有效應(yīng)用劑量高，這不僅使治療費用增高，且?guī)砗芏酀撛诘母弊饔?，如過量成骨和非手術(shù)部位異位成骨等[6]。與同源二聚體相比，BMP異源二聚體在誘導(dǎo)成骨方面起效劑量更低、作用更顯著[7-8]，但目前對于其具有更強誘導(dǎo)成骨能力的機制尚不十分清楚，應(yīng)用于臨床也存在諸多限制。本文就BMP異源二聚體的種類結(jié)構(gòu)、作用機制和在誘導(dǎo)成骨方面的研究作一綜述。

1 BMP異源二聚體的種類結(jié)構(gòu)

活性BMP分子由兩條肽鏈經(jīng)二硫鍵連接組成，兩條肽鏈相同則稱為同源二聚體，兩條肽鏈不同則稱為異源二聚體[9]。不同單體構(gòu)成的BMP異源二聚體具有不同功能[7,10-13]。Wang等[14]于1988年首次發(fā)現(xiàn)了BMP異源二聚體，這種BMP在體內(nèi)誘導(dǎo)成骨方面表現(xiàn)出很高的效率。Sampath等[15]于1990年首次證明所提取的生長因子為BMP-2/7異源二聚體。

根據(jù)序列相似性及已知功能，可將人體內(nèi)的BMP再分為7個亞家族：BMP-2/4；BMP-3/3b；BMP-5/6/7/8/8b；BMP-9/10；BMP-11/GDF-8；BMP-12/13/14；BMP-15/GDF-9[16]。研究發(fā)現(xiàn)，BMPs發(fā)揮其活性的效率似乎與兩個單體的同源性有關(guān)：兩個單體攜帶的基因同源性越少，誘導(dǎo)成骨能力越強[17-18]。因此，包含兩條來自同一亞家族單體的BMP異源二聚體的成骨效能要強于同源二聚體；類似的，包含兩條來自不同亞家族單體的BMP異源二聚體的成骨效能要強于包含兩條來自同一亞家族單體的BMP異源二聚體。另外，組成二聚體的單體本身的成骨效能也對新組成的二聚體有影響，因此骨組織工程領(lǐng)域的研究大多集中在來自不同亞家族的兩個單體組成的BMP異源二聚體，尤其是BMP-2/4(Ⅰ類BMP)和BMP-5/6/7/8/8b(Ⅱ類BMP)兩個亞家族[19]。

不活躍的BMP前體蛋白經(jīng)過二聚并被切割后，產(chǎn)生具有生物活性的BMP配體及缺乏信號活性的前結(jié)構(gòu)域[13]。Ⅰ類BMP前體蛋白具有兩個高度保守的共切割基序，Ⅱ類BMP前體蛋白只有一個單一的保守切割基序[20]。Ⅱ類BMP前體蛋白被切割于單一的保守位點后，產(chǎn)生一個非共價連接的前結(jié)構(gòu)域/配體復(fù)合物[21]。Ⅰ類BMP前體蛋白先在配體結(jié)構(gòu)域附近的S1位點被切割后，BMP配體與前結(jié)構(gòu)域形成一個短暫的非共價復(fù)合物；然后在前結(jié)構(gòu)域內(nèi)靠近配體的S2位點被切割，配體在復(fù)合物被破壞后從中釋放出來[22]。不同BMP前結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)各自同源二聚體的活性方面起著不同作用，它們雖然缺乏信號活性，但有助于活性配體的二聚、折疊和分泌[20]。Neugebauer等[20]最近發(fā)現(xiàn)當(dāng)BMP-4和BMP-7配體表達于BMP-4前結(jié)構(gòu)域單獨存在的情況時，BMP-4/7異源二聚體配體存在高度穩(wěn)定的表達水平，而同源二聚體中的任意一種均極少被觀察到；當(dāng)BMP-4和BMP-7配體表達于BMP-7前結(jié)構(gòu)域單獨存在的情況時，BMP-4/7異源二聚體配體很少存在，而存在高表達水平的BMP-7(而不是BMP-4)同源二聚體。這表明BMP-7前結(jié)構(gòu)域優(yōu)先驅(qū)動BMP-7前體蛋白的同聚，而BMP-4前結(jié)構(gòu)域優(yōu)先驅(qū)動BMP-4和BMP-7前體蛋白的異聚。這一發(fā)現(xiàn)可能對如何調(diào)節(jié)BMP同源二聚體及異源二聚體在體內(nèi)的相對含量具有重要指導(dǎo)意義。

當(dāng)BMP-4和BMP-7在非洲爪蟾同一細胞中共同表達時，優(yōu)先形成BMP-4/7異源二聚體，而不是同源二聚體[23]；而當(dāng)BMP-2和BMP-7在斑馬魚同一細胞中表達時形成等量的BMP-2/7異源二聚體和相應(yīng)同源二聚體[24]，這表明異源二聚體和同源二聚體的相對含量可能因種屬和細胞類型而存在差異。Kim等基于前期研究[20]提出假設(shè)：在特定細胞類型中，某一過量的Ⅱ類BMP形成同源二聚體的同時可形成異源二聚體以補償其他單一Ⅱ類BMP的缺失[13]。他們設(shè)計產(chǎn)生了一種BMP-7R-GFlag基因突變小鼠，BMP-7R-Gflag純合子表達一種不可切割、不活躍的BMP-7前體蛋白。這種突變消除了BMP-7同源二聚體和所有其他與BMP-7R-Gflag異聚所形成異源二聚體的功能。研究結(jié)果顯示，BMP-7空白突變純合子成活，但BMP-7R-GFlag純合子胚胎致死且有不同程度的表型缺陷，并且廣泛地降低了BMP活性，這表明含BMP-7的異源二聚體在早期胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，也驗證了上述假設(shè)?？梢哉f，BMP異源二聚體與同源二聚體在不同組織和不同發(fā)育階段可能存在很大的功能差異。該研究同時表明，在哺乳動物發(fā)育過程中，BMP-7主要與BMP-2或BMP-4形成異源二聚體而發(fā)揮作用；也解釋了為何無論BMP-4抑或BMP-7突變都會導(dǎo)致人類相似的先天性表型缺陷[13]。

2 BMP異源二聚體的信號通路

2.1 BMP異源二聚體受體

BMP信號依賴于分泌釋放的配體和靶細胞表面表達的Ⅰ型受體(BMPR-Ⅰ)和Ⅱ型受體(BMPR-Ⅱ)，一個成熟的配體受體復(fù)合物需要一個配體二聚體、兩個BMPR-Ⅰ和兩個BMPR-Ⅱ[25]。BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ是目前唯一已知的一類具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性的人單向跨膜細胞表面受體，分別有4種和3種亞型[26]。Ser/Thr蛋白激酶受體R3(ALK1)、激活素1型受體(ALK2)、BMPR-1A(ALK3)、BMPR-1B(ALK6)等作為BMPR-Ⅰ；BMPR-2、激活素2A型受體(ACVR-2A)及ACVR-2B等作為BMPR-Ⅱ[27]。

不同的BMP配體對兩種受體的親和力不同(圖1)。BMP-2和BMP-4對ALK-3和ALK-6的親和力高，但對BMPR-Ⅱ的親和力很低[28]；相反，BMP-6和BMP-7對BMPR-Ⅱ具有高親和力，而對BMPR-Ⅰ的親和力中等或低下[29-31]。相較之下，BMP-2/6異源二聚體對BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ都具有很高的親和力[31]，從而能更快、更穩(wěn)定地形成配體/受體復(fù)合物，更早、更強地激活下游信號通路，包括Smad通路(如Smad1/5/8)及非Smad通路(如ERK、p38等)。Buijs等[32]的研究也表明，BMP-2/7異源二聚體對BMPR的親和力明顯高于其同源二聚體。此外，BMP異源二聚體能促進BMPR的高水平表達，加快BMPR復(fù)合物的形成[33]。

圖1 不同BMP配體對兩種受體親和力差異示意圖Fig.1 Schematic diagram of the difference in affinity of different BMP ligands for two receptors

2.2 BMP異源二聚體Smad通路

BMPs作為配體與受體結(jié)合后激活一系列復(fù)雜的下游胞內(nèi)介質(zhì)，包括經(jīng)典的Smad通路及其他非Smad通路[34]。Smad通路是成骨細胞和成軟骨細胞及其前體細胞所共有的，并在這些細胞中受到嚴格的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2和BMP-7能輕度促進Smad1/5/8的磷酸化水平；而BMP-2/7異源二聚體可明顯增強Smad1/5/8的磷酸化水平；兩者均不增加Smad含量[35]。非Smad通路也可能是實現(xiàn)BMP異源二聚體更強的誘導(dǎo)成骨能力的原因之一。Miao等[36]證明BMP-2/7異源二聚體具有刺激大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨的強大能力，且ERK信號通路可能部分增強其成骨效應(yīng)。Zhang等[37]的研究表明，BMP異源二聚體在不同細胞類型中的效應(yīng)差異可能與ERK信號通路在不同細胞中發(fā)揮不同作用有關(guān)。

2.3 BMP異源二聚體胞外拮抗

由于BMP存在胞外循環(huán)，某些胞外拮抗劑通過與BMP結(jié)合而使BMP無法結(jié)合并激活BMPR，包括Noggin、Chordin、Follistatin和Follistatin相關(guān)基因(FLRG)、Ventropin、Dan/Cerebus家族(Dan、Gremlin、Caronte、Dante、Sclerostin)及原腸形成蛋白基因(TSG)等[16,38]。

同源二聚體與異源二聚體對胞外拮抗劑的反應(yīng)有所不同，如Noggin對BMP-2和BMP-7有明顯的拮抗作用，而對BMP-2/7異源二聚體沒有或僅有輕度拮抗作用[19]。其可能是由于結(jié)構(gòu)對稱的Noggin無法高度結(jié)合結(jié)構(gòu)不對稱的BMP-2/7異源二聚體；還可能部分歸因于異源二聚體配體/受體復(fù)合物的加速形成，使異源二聚體與Noggin結(jié)合減少[39]。與之相反，Chordin對BMP-4/7異源二聚體與BMP-4同源二聚體具有相似的親和力[23]。但總的來說，許多拮抗劑(如Noggin、CIZ等)對BMP異源二聚體表現(xiàn)出更低的親和性，從而使BMP異源二聚體的骨誘導(dǎo)效率明顯高于BMP同源二聚體[39-40]。

3 BMP異源二聚體誘導(dǎo)成骨研究

3.1 基因治療

基因治療可能是骨缺損的可行療法之一，使用基因載體將生長因子傳遞至骨缺損部位，靶基因可持續(xù)和潛在可調(diào)控地誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性BMP，從而促進骨愈合。基因載體可分為病毒載體和非病毒載體，近年來人們對非病毒載體給予了更多關(guān)注。Loozen等[41]對山羊間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)進行pBMP-2/pBMP-6、pBMP-2/pBMP-7共轉(zhuǎn)染或單獨轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明BMP-2/6及BMP-2/7異源二聚體均具有高效的誘導(dǎo)成骨能力。他們在對大鼠成纖維細胞的研究中也取得一致的實驗結(jié)果，說明即使轉(zhuǎn)染細胞沒有直接成骨潛能，也可以實現(xiàn)體外BMP基因傳遞，這表明轉(zhuǎn)染細胞主要作為BMP的“工坊”而發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用[42]。

非病毒載體雖然具有優(yōu)異的生物安全性、攜帶基因量大、制備簡單等優(yōu)點，但低轉(zhuǎn)染率一直限制其被廣泛使用[43]。Kaipel等[44]期望利用陽離子聚合物增強pBMP-2/pBMP-7的共轉(zhuǎn)染率，他們將加載pBMP-2/pBMP-7及靶細胞的纖維蛋白基因激活基質(zhì)(gene-activated matrix，GAM)以添加或不添加陽離子聚合物的方式植入大鼠股骨缺損區(qū)，結(jié)果顯示添加陽離子聚合物的共轉(zhuǎn)染組成骨少于不添加的共轉(zhuǎn)染組，說明陽離子聚合物未能提高反而降低了pBMP-2/pBMP-7的共轉(zhuǎn)染率。

非病毒載體基因轉(zhuǎn)染的物理方法有電穿孔和超聲穿孔，它們分別利用電能和機械能在細胞膜中產(chǎn)生瞬時孔隙，從而允許外源DNA進入胞內(nèi)[45-46]。由于牙周組織中存在多種類型MSCs[47-48]，Kawai等設(shè)想通過電穿孔的方式將pCAGGS-BMP-2/7載體轉(zhuǎn)染大鼠牙周組織，促進牙周MSCs向成骨細胞分化，從而誘導(dǎo)牙槽骨再生[49]。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染5 d后實驗組觀察到新生牙槽骨再生，7 d后新生骨組織與原有牙槽骨組織連接，且成骨后骨質(zhì)優(yōu)于lacZ基因?qū)φ战M。他們的最新研究結(jié)果表明，該法最多可提升3周的牙槽骨再生潛能[50]。相較于需要植骨以修復(fù)骨缺損的手術(shù)方法而言，BMP-2/7非病毒載體基因轉(zhuǎn)染結(jié)合電穿孔相對安全且微創(chuàng)，是一種很有前景的骨缺損修復(fù)非手術(shù)治療方案。

與電穿孔相比，超聲穿孔更加安全、無創(chuàng)[46]。超聲介導(dǎo)的微泡增強基因轉(zhuǎn)染已被證明能促進DNA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，且具有高度的生物安全性[51-52]。Nomikou等[53]進一步篩選出生物素化的陽離子微泡是該轉(zhuǎn)染方式中最佳的微泡表面修飾方式。他們在前期已證明超聲介導(dǎo)的pBMP-2/pBMP-7共轉(zhuǎn)染優(yōu)于被動轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，設(shè)計了一種超聲介導(dǎo)下，加載pBMP-2/pBMP-7、微泡及靶細胞的GAM[54-55]。體外及裸小鼠體內(nèi)實驗表明其具有優(yōu)異的誘導(dǎo)成骨能力，且該GAM作為一種可由超聲調(diào)控的、比較成熟的基因載體系統(tǒng)，為BMP異源二聚體誘導(dǎo)成骨的基因治療提供了一種新策略。

3.2 種屬及細胞類型特異性

BMP在不同種屬動物或不同細胞類型中的含量可能是不一樣的[20,24]，且在不同組織和不同發(fā)育階段存在很大的功能差異[13]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)BMP異源二聚體的誘導(dǎo)成骨能力可能因種屬及細胞類型而存在差異[56-58]。Zhang等[59-60]發(fā)現(xiàn)，BMP-2/7異源二聚體在體內(nèi)或體外均能顯著促進人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)的成骨分化，但與同源二聚體BMP-2或BMP-7相比，BMP-2/7異源二聚體不具有更強的誘導(dǎo)成骨能力。此外，與小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1相比，BMP-2/7異源二聚體在hADSCs成骨分化過程中也不具有更強的誘導(dǎo)成骨能力，這可能與ERK信號通路在MC3T3-E1和hADSCs中發(fā)揮不同作用有關(guān)[37]。Betz等[45]研究BMP在大鼠骨骼肌組織中的誘導(dǎo)成骨能力時發(fā)現(xiàn)，無論在高劑量還是低劑量時，BMP-2都比BMP-2/6和BMP-2/7異源二聚體具有更高的誘導(dǎo)成骨能力，在較低劑量下能更快誘導(dǎo)肌肉成骨細胞發(fā)生；在高劑量下BMP-2/7異源二聚體對肌肉的成骨作用明顯強于BMP-2/6異源二聚體。

3.3 劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系

先前許多小鼠細胞類型研究[61-64]表明，BMP異源二聚體的成骨過程存在劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。在低劑量時BMP異源二聚體具有更好的誘導(dǎo)成骨能力；在高劑量時因破骨效應(yīng)增強，且成骨與破骨最大作用效果不具備優(yōu)勢，其誘導(dǎo)成骨能力與相應(yīng)同源二聚體無明顯差異。在Zhang等[59]對hADSCs成骨分化的研究中，BMP-2/7異源二聚體在200 ng/mL時達到最大效應(yīng)濃度，并未在5～50 ng/mL濃度時觀察到成骨，與先前研究結(jié)果不符，但是在50～200 ng/mL的濃度區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。因此，在一定劑量范圍內(nèi)BMP異源二聚體仍然存在劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，但其起效濃度及最大效應(yīng)濃度因種屬或細胞類型而異。

3.4 ATRA與BMP異源二聚體的聯(lián)合應(yīng)用

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的酸性衍生物，能夠調(diào)控多種組織細胞的增殖分化，在細胞生長發(fā)育及代謝方面有廣泛的生物學(xué)特性[65]。鑒于此，有研究者設(shè)想將適宜濃度的ATRA與BMP聯(lián)合應(yīng)用以促進成骨，且期望減少BMP的使用劑量。有研究表明，50 ng/mL的BMP-2/7異源二聚體可完全拮抗300 ng/mL的ATRA對成骨細胞分化的抑制作用并促進成骨發(fā)生[66]，而ATRA能抑制BMP-2/7異源二聚體誘導(dǎo)的破骨細胞分化及破骨活性，因此聯(lián)合應(yīng)用ATRA與BMP異源二聚體有望成為治療由破骨細胞過度活躍引起的骨喪失疾病的一種新方法[67]。Liu等[68]的研究表明，聯(lián)合應(yīng)用ATRA與BMP-2/7異源二聚體較同源二聚體誘導(dǎo)了更高的早期成骨細胞分化和細胞活性，而在誘導(dǎo)晚期成骨細胞分化時并不占優(yōu)勢。沈晨曦等[69]將ATRA與BMPs單獨或聯(lián)合應(yīng)用于骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)及MC3T3-E1中，比較研究堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表達效果的差異。研究結(jié)果顯示，ATRA與BMP-2/7異源二聚體聯(lián)合應(yīng)用可顯著協(xié)同促進BMSCs的ALP表達，而兩者聯(lián)合應(yīng)用不能協(xié)同促進MC3T3-E1細胞ALP活性升高，說明ATRA與BMP-2/7異源二聚體聯(lián)合應(yīng)用于不同細胞類型中的成骨效能不一。

3.5 BMP異源二聚體在口腔頜面外科領(lǐng)域的研究

牽張成骨(distraction osteogenesis，DO)能有效重建牙槽骨垂直高度，然而該技術(shù)存在成骨時間長的缺點，限制其廣泛應(yīng)用[70]。Ren等[71]設(shè)計了一種加載rhBMP-2/7異源二聚體的RADA16水凝膠支架，相比于rhBMP-2組，其在新西蘭白兔下頜DO過程中具有更好的誘導(dǎo)成骨能力，但仍有待探索其分子機制及BMP最適濃度等。

在口腔種植臨床治療中，種植體維持長期穩(wěn)定需要良好的骨結(jié)合，同時種植體頸部需形成良好的“袖口”狀軟組織封閉[72]。對純鈦種植體進行表面改性，同時促使種植體周軟硬組織結(jié)合是近來口腔種植領(lǐng)域的主要研究方向[73]。Ettelt等[74]利用層層自組裝技術(shù)，在TiO2表面上事先加載一層鏈霉親和素(streptavidin，SA)單分子層，然后再在其上加載靜電吸附生物素化肝素(biotinylated heparin，bHP)的成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)，研究結(jié)果表明該方式具有最強成纖維細胞增殖效應(yīng)。此外，在SA單分子層上加載bBMP-2顯著增強了成骨細胞的增殖；在SA單分子層上加載bBMP-2/6及bFn顯著增強了細胞粘附?；诖耍麄冊O(shè)想了一種加載BMP-2/6異源二聚體、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)及FGF-2的多重生物功能化TiO2表面，以增強成骨細胞及成纖維細胞的選擇性增殖和粘附，從而達到種植初期骨整合及早期軟組織封閉的效果。

4 展 望

BMP異源二聚體因較同源二聚體具有更高的誘導(dǎo)成骨能力而受到廣泛關(guān)注。因由不同BMP單體組成，各種BMP異源二聚體在不同生物的各生長階段及不同細胞類型中可能存在著功能差異，這在一定程度上將限制BMP異源二聚體的研究及應(yīng)用。目前對于BMP異源二聚體誘導(dǎo)成骨的作用機制尚不十分清楚，仍有待于進一步研究?；蛑委熌芸沙掷m(xù)且可調(diào)控地誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性BMP異源二聚體，是今后骨缺損修復(fù)的一種可行療法。對于特定的細胞類型(如鼠源細胞)，BMP異源二聚體的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性，且達到某一濃度時能促進破骨發(fā)生，因此以最佳效應(yīng)劑量比聯(lián)合其他藥物協(xié)同應(yīng)用以抑制BMP異源二聚體的破骨發(fā)生，最大程度地提升其誘導(dǎo)成骨能力以降低使用劑量，可能也是治療骨缺損疾病的一種方法。理想的BMP異源二聚體緩釋體系能夠長時間保持BMP異源二聚體的緩慢釋放，且合適的支架材料能提供優(yōu)異的骨引導(dǎo)性，將是今后研究的熱點。