全降解鎂合金組織工程支架孔隙特征與性能關(guān)系研究

熊美萍，賈高智，袁廣銀

我國每年因外傷、感染、腫瘤和先天性等原因?qū)е碌念M骨缺損的發(fā)生率約為0.24%[1]。頜骨缺損不僅影響容貌及頜面部的正常生理功能，還會帶來心理問題，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，骨組織工程學(xué)的發(fā)展，使頜骨缺損尤其是大段骨缺損的功能性重建修復(fù)變成可能，并成為當(dāng)前研究熱點[2-3]。其中，支架材料在組織工程中起關(guān)鍵作用。理想的支架材料應(yīng)滿足如下條件[4-5]。①生物相容性良好：支架作為細(xì)胞生長和繁殖的場所，要求支架材料及其降解產(chǎn)物無毒、無炎癥反應(yīng)。為便于細(xì)胞的粘附、增殖及生長，支架材料還應(yīng)具有骨傳導(dǎo)與骨誘導(dǎo)性能。②具備體內(nèi)降解性能：支架材料在完成其作用后應(yīng)能夠逐漸降解至消失，隨著新生骨組織的長入，最終達(dá)到自體骨修復(fù)的目的。支架降解的速率需要和新骨的形成速率相匹配。③三維聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)：適合的孔隙尺寸以適應(yīng)新生骨組織的生長，便于新的血管和神經(jīng)的長入，還要便于體系內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)的交換和代謝產(chǎn)物的運輸。④適宜的力學(xué)強度和可塑性：其力學(xué)性能應(yīng)與骨組織相匹配(人體松質(zhì)骨彈性模量為0.1～0.5 GPa,抗壓強度為4～12 MPa[6])。此外還需良好的加工工藝性能，以便能加工成所需形狀。

和陶瓷及高分子材料相比，鎂合金作為一種可降解醫(yī)用金屬生物材料具有更好的綜合性能，包括更高的強韌性以及更好的加工工藝性，并且鎂合金材料在人體環(huán)境中會發(fā)生腐蝕降解，可望實現(xiàn)植入物在體內(nèi)逐漸降解并最終消失。作者以及他人的研究均表明，鎂合金降解過程中釋放出的鎂離子能夠促進成骨細(xì)胞的粘附、增殖以及類骨質(zhì)的生長，具有顯著的成骨誘導(dǎo)作用[7-9]。此外，還有研究表明鎂離子能促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)，有望在引導(dǎo)血管生成的同時促進成骨、破骨細(xì)胞的分化[10]。由此可見，鎂合金具有成為理想的骨組織工程支架材料的潛質(zhì)。

本文研究了組織工程支架用鎂合金多孔結(jié)構(gòu)的制備工藝調(diào)控，研究了不同孔隙特征參數(shù)(圓形孔、不規(guī)則孔以及孔徑大小等)對力學(xué)性能、細(xì)胞行為和降解行為的影響規(guī)律，以期為進一步開展鎂合金骨組織工程支架在口腔缺損修復(fù)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用奠定實驗和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

球形和不規(guī)則多面體形氯化鈉顆粒，顆粒尺寸約800 μm，如圖1所示。高純鎂(純度≥99.98%)、鎂合金(Mg-Nd-Zn-Zr，簡稱JDBM)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡SEM(JSM 7600F，日本)、微機斷層掃描(micro CT，Bruker Skyscan 1176，美國)、室溫壓縮力學(xué)性能測試機(Zwick AG-100KN，德國)、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(Gibco，美國)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)和熒光顯微鏡(Olympus IX71，日本)。

圖1 NaCl顆粒微觀形貌Fig.1 Micrograph of NaCl particles

1.2 支架制備方法

采用模板復(fù)制法制備開孔多孔鎂基支架，將松散態(tài)NaCl顆粒利用熱壓燒結(jié)工藝制成開孔多孔預(yù)制體，燒結(jié)壓強7.5 kPa，燒結(jié)溫度為720 ℃，燒結(jié)時間為24 h；使用80 t液壓機進行滲流鑄造，將預(yù)制體和鎂錠放入模具后由電磁感應(yīng)設(shè)備加熱鎂料至720 ℃熔化，熔化過程在96%(體積分?jǐn)?shù))CO2+4%(體積分?jǐn)?shù)) SF6氣氛中進行，隨后沖頭以3 mm/min速度進行壓力鑄造，冷卻后即得預(yù)制體和鎂的復(fù)合材料。通過線切割將復(fù)合材料加工為φ=10 mm、d=2 mm的圓片和φ=10 mm、d=15 mm的圓棒。復(fù)合材料中的NaCl預(yù)制體經(jīng)水溶解濾除，并用1%(體積分?jǐn)?shù))硝酸乙醇超聲清洗多孔支架30 s。

1.3 微結(jié)構(gòu)及力學(xué)測試

表面微觀形貌觀察使用掃描電子顯微鏡SEM觀測，利用微機斷層掃描檢測多孔支架的內(nèi)部及橫截面形貌，空間分辨率為9 μm。通過Mimics軟件對micro CT數(shù)據(jù)重構(gòu)分析，計算出表面積。對1.2中制備的圓棒進行室溫壓縮力學(xué)性能測試，壓縮速率為1 mm/min，取應(yīng)變量為0.2%平行于彈性區(qū)的截線與壓縮曲線的交點為壓縮屈服強度，模量為彈性區(qū)的斜率。

1.4 降解性能測試

在Hank’s模擬體液中進行浸泡析氫實驗，記錄產(chǎn)生氫氣體積。在濕度95%、37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)條件下進行浸泡降解形貌測試，12孔板內(nèi)將1.2中制備的圓片狀樣品(1件/孔)浸泡于3 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為DMEM(Gibco，美國)+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(FBS，Gibco，美國)+1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗(青/鏈霉素，Gibco，美國)，定期更換新鮮培養(yǎng)液。

1.5 支架與細(xì)胞共培養(yǎng)觀察

采用小鼠顱頂前成骨細(xì)胞株(MC3T3-E1)，實驗采用第3～8代細(xì)胞。將降解7 d的純鎂多孔支架在超聲條件下浸泡在75%(體積分?jǐn)?shù))無水乙醇消毒20 min 后，在細(xì)胞超凈臺內(nèi)經(jīng)2 h 吹干待用。將MC3T3-E1細(xì)胞懸液稀釋為2×106個/mL，在12孔板內(nèi)每孔逐滴加入50 μL細(xì)胞懸液置于小圓片樣品表面，隨后加入3 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。細(xì)胞在支架表面粘附形貌采用Live/Dead活死細(xì)胞染色法觀察。

2 結(jié) 果

2.1 球形孔和不規(guī)則多面體形孔的微結(jié)構(gòu)檢測

micro CT檢測支架橫截面及內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示，結(jié)果顯示兩組支架的孔隙形貌與NaCl顆粒的幾何形狀保持一致，且支架內(nèi)部未見NaCl顆粒殘留。對兩組支架的三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)球形孔支架的孔隙率為75%，表面積與宏觀體積比為(3.43±0.15)/mm；不規(guī)則多面體形孔支架的孔隙率為68%，表面積與宏觀體積比為(7.37±0.51)/mm。SEM觀察球形孔支架和不規(guī)則多面體形孔支架的微觀結(jié)構(gòu)如圖3所示，結(jié)果顯示兩組支架不僅復(fù)制了NaCl顆粒的外形及尺寸，更重要的是孔與孔之間的聯(lián)通孔構(gòu)成了三維聯(lián)通的開孔多級孔尺寸結(jié)構(gòu)。球形孔支架的微觀結(jié)構(gòu)在三維空間具有均勻重復(fù)的孔隙結(jié)構(gòu)，而不規(guī)則多面體孔支架由于主孔在三維空間隨機的取向以及不同的形貌和尺寸使其三維孔隙結(jié)構(gòu)沒有重復(fù)性。此外，球形孔支架的聯(lián)通孔尺寸主要為200～350 μm，而不規(guī)則形多面體孔支架的聯(lián)通孔尺寸主要為50～300 μm。

圖2 多孔鎂支架的micro CT橫截面形貌 Fig.2 Cross-sectional images of the scaffolds from micro CT results

圖3 多孔鎂支架的SEM微觀形貌Fig.3 SEM images of the microstructures of spherical pore structure

2.2 多孔鎂合金支架的壓縮力學(xué)測試

對鑄態(tài)鎂合金JDBM支架和540 ℃、8 h固溶處理后的JDBM球形孔結(jié)構(gòu)支架進行壓縮力學(xué)性能測試和微觀組織觀察，結(jié)果如圖4～5所示。壓縮力學(xué)曲線顯示鑄態(tài)JDBM鎂合金支架具有更高的屈服強度和彈性模量，分別為11.50 MPa和1.01 GPa，但是鑄態(tài)支架在最大抗壓強度(12.43 MPa)后曲線局部出現(xiàn)鋸齒狀波動，在45%應(yīng)變后應(yīng)力明顯開始下降。固溶處理后的多孔JDBM鎂合金支架應(yīng)力隨應(yīng)變增加平穩(wěn)升高，呈現(xiàn)典型的松質(zhì)骨壓縮力學(xué)曲線特征，但壓縮屈服強度和彈性模量分別降低至4.33 MPa和0.44 GPa。圖5中固溶處理前在支架孔壁表面可清晰觀察到網(wǎng)絡(luò)狀分布的強化相Mg12Nd，可以顯著提高支架的力學(xué)性能。然而，Mg12Nd金屬間化合物在孔壁變形中由于自身的脆性會產(chǎn)生裂紋，表現(xiàn)為變形曲線中應(yīng)力的降低。固溶處理后該強化相消失，固溶強化效果弱于第二相強化效果，造成了壓縮屈服強度的降低，但多孔支架在變形中的結(jié)構(gòu)完整性提高。

圖4 JDBM鎂合金球形孔支架壓縮力學(xué)曲線Fig.4 Compressive stress-strain curves of JDBM scaffolds

圖5 固溶處理前后JDBM鎂合金微觀形貌Fig.5 Typical microstructure of pore wall before and after solution treatment

2.3 降解性能測試

圖6是球形孔結(jié)構(gòu)和不規(guī)則多面體孔結(jié)構(gòu)的純鎂支架在Hank’s模擬體液中的析氫量測試結(jié)果，兩種支架都呈現(xiàn)在初期快速釋放氫氣，10 d后氫氣釋放量趨于平穩(wěn)。不同的是，在整個析氫實驗中不規(guī)則多面體形孔支架的氫氣釋放量都顯著多于球形孔結(jié)構(gòu)支架。在第14天后不規(guī)則多面體形孔支架的析氫量約是球形孔結(jié)構(gòu)支架的2倍。兩種支架不同的析氫速率和析氫總量與自身的微結(jié)構(gòu)特征直接相關(guān)，在相同的宏觀體積下，不規(guī)則多面體形孔支架的總表面積約是球形孔結(jié)構(gòu)支架總表面積的1.15倍，與Hank’s溶液具有更多的接觸反應(yīng)面積。因此，在相同時間內(nèi)不規(guī)則多面體形孔支架會產(chǎn)生更多的析氫量；同時由于不規(guī)則形孔支架較低的孔隙率使支架具有比球形孔結(jié)構(gòu)支架更多的基體質(zhì)量，在后期穩(wěn)定降解過程中會產(chǎn)生更多的析氫總量。圖7是多孔鎂支架在細(xì)胞培養(yǎng)條件下浸泡14 d后的宏觀形貌，到第14天時降解產(chǎn)物完全覆蓋了支架表面，孔隙結(jié)構(gòu)已幾乎不可識別。

圖6 純鎂支架析氫實驗結(jié)果Fig.6 Hydrogen evolution results of the two Mg scaffolds

圖7 純鎂支架浸泡降解前后宏觀形貌Fig.7 Macrographs of Mg scaffolds before and after immersion tests

2.4 細(xì)胞與支架共培養(yǎng)觀察

選擇靜態(tài)浸泡7 d后的多孔純鎂支架進行成骨細(xì)胞直接培養(yǎng)，該時間點的支架降解環(huán)境較為穩(wěn)定而且孔隙結(jié)構(gòu)仍保留完好。從圖8中的染色結(jié)果可以看出接種MC3T3-E1成骨細(xì)胞12 h后兩組支架表面均粘附有大量活細(xì)胞。但是，不規(guī)則多面體結(jié)構(gòu)的支架存在較多死細(xì)胞，孔隙中發(fā)現(xiàn)大量氣泡，細(xì)胞在孔壁夾角有明顯聚集傾向。

圖8 兩組純鎂支架上MC3T3-E1成骨細(xì)胞Live/Dead染色結(jié)果Fig.8 Live/Dead staining result of MC3T3-E1 osteoblasts on Mg scaffolds

3 討 論

模板復(fù)制法是較為廣泛的多孔結(jié)構(gòu)制備方法，需先設(shè)計預(yù)制體模板或造孔粒子，作為被復(fù)制對象，通過機械混合或壓力滲流等技術(shù)將目標(biāo)支架材料填充到預(yù)制體模板或造孔粒子的空隙進而形成二者的復(fù)合材料，隨后通過溶解濾除或熱分解去除預(yù)制體模板或造孔粒子，將預(yù)制體模板或造孔粒子的結(jié)構(gòu)形狀和尺寸復(fù)制為支架的孔結(jié)構(gòu)和孔尺寸[11]。常用的造孔介質(zhì)有鹽粒(NaCl)[12-13]、石蠟(paraffin)[14]和聚氨酯泡沫(polyurethane foam)等。模板法因?qū)嵤┓奖?、支架的孔形和孔尺寸精確可控的特征，廣泛應(yīng)用于金屬、陶瓷和聚合物的多孔結(jié)構(gòu)制備[15]。

NaCl的熔點為801 ℃，在25 ℃水中的溶解度為36 g/L，其高熔點和在水溶液中快速溶解的特性使其成為模板復(fù)制法制備多孔材料中被使用最多的造孔粒子。本研究中使用了尺寸相近的NaCl顆粒，模板濾除后都呈現(xiàn)完全開孔的空間結(jié)構(gòu)，但不同的孔形結(jié)構(gòu)對支架的聯(lián)通性產(chǎn)生了顯著差異。球形孔結(jié)構(gòu)支架內(nèi)的聯(lián)通孔為大尺寸(200～350 μm)且集中分布，不規(guī)則多面體孔結(jié)構(gòu)支架中聯(lián)通孔為小尺寸(50～250 μm)且各尺寸聯(lián)通孔相對數(shù)量相近；同時兩種支架的微觀結(jié)構(gòu)表明，球形孔結(jié)構(gòu)支架內(nèi)的聯(lián)通孔在孔壁均勻分布，不規(guī)則多面體孔結(jié)構(gòu)支架內(nèi)的聯(lián)通孔在孔壁分布及取向都呈隨機化。據(jù)此可以判斷球形孔結(jié)構(gòu)支架比不規(guī)則多面體孔結(jié)構(gòu)支架具有更高的聯(lián)通性能。

金屬鎂化學(xué)性質(zhì)活潑，在溶液中與水通過氧化還原反應(yīng)形成氫氧化鎂并釋放氫氣，這也是鎂在體內(nèi)降解的基本原理，但是在生理環(huán)境中存在的Cl-會破壞氫氧化鎂膜層，加速基體腐蝕[16]。多孔結(jié)構(gòu)賦予鎂支架更大的比表面積，而且聯(lián)通的孔隙特征為腐蝕介質(zhì)的進入提供了便利，這樣鎂的腐蝕過程將被進一步加快。目前對多孔鎂支架降解規(guī)律的研究存在共同的認(rèn)識，即孔隙率越高支架降解速率越快[17]。本研究中兩組多孔鎂支架雖然微結(jié)構(gòu)存在差異，但降解相同時間后表面多孔結(jié)構(gòu)均被降解沉積物填充，基本喪失了多孔結(jié)構(gòu)的聯(lián)通性。不同的是孔隙率較低，比表面積較高的不規(guī)則多面體形孔支架呈現(xiàn)更高的析氫速率，氫氣的快速釋放可能會抑制支架微結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞的代謝和組織的長入。

本研究測試了微結(jié)構(gòu)中金屬間化合物對多孔支架力學(xué)性能的影響。Mg12Nd是JDBM合金的主要強化相,該合金具有優(yōu)越的力學(xué)性能、耐腐蝕性能和良好的生物相容性[18]，其在孔壁的網(wǎng)絡(luò)狀分布有效提高了支架的抗壓屈服強度，但是該金屬間化合物較硬的物理特征導(dǎo)致在變形中微結(jié)構(gòu)局部斷裂和應(yīng)力下降。對多孔鎂合金支架的固溶處理雖然導(dǎo)致了力學(xué)強度的下降，但是變形過程中應(yīng)力無下降現(xiàn)象，與松質(zhì)骨的變形特征更為一致[19]。

細(xì)胞是材料在植入后首先與其發(fā)生作用的生命單元，了解細(xì)胞與材料的相互作用是生物醫(yī)用材料的研究重點，鎂及鎂的浸提液對細(xì)胞行為的影響已有大量報道[20-21]。多孔鎂支架的三維孔隙結(jié)構(gòu)是給細(xì)胞在空間范圍進行遷移、增殖及分化和最終礦化和成骨提供場所，通過在多孔鎂支架上進行體外細(xì)胞直接培養(yǎng)可以初步研究孔隙特征與細(xì)胞活性及粘附的關(guān)系。在相同表觀體積條件下不規(guī)則多面體形孔支架的總表面積更大，細(xì)胞接種時落在支架上的細(xì)胞數(shù)量可能多于球形孔結(jié)構(gòu)支架，然而大的比表面積可能會造成孔結(jié)構(gòu)內(nèi)微環(huán)境中離子濃度、pH值和滲透壓等的明顯改變，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常代謝行為。

綜上所述，多孔鎂基支架的微結(jié)構(gòu)對聯(lián)通性和降解性能有直接影響，微結(jié)構(gòu)中第二相金屬間化合物可顯著提高支架的力學(xué)強度，但是多孔結(jié)構(gòu)過快的降解速率不利于成骨細(xì)胞在支架孔隙內(nèi)部的粘附鋪展和增殖。在后續(xù)研究中，需要對多孔鎂及鎂合金支架開展功能化涂層修飾，提高支架的耐腐蝕性能和生物相容性，進一步探索微結(jié)構(gòu)與生理組織的適配機制。