玉米雄性不育突變體mi-ms-3的遺傳分析及分子鑒定

田士可 秦心兒 張文亮 董 雪 代明球 岳 兵

研究簡報

玉米雄性不育突變體的遺傳分析及分子鑒定

田士可 秦心兒 張文亮 董 雪 代明球 岳 兵*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070

玉米是雜種優(yōu)勢利用的最好的作物之一, 雄性不育材料作為一種寶貴的種質(zhì)資源, 對雜種優(yōu)勢的利用具有十分重要的價值。前期篩選得到1個雄性不育突變體, 并將其命名為。該突變體表現(xiàn)為: 雄穗花藥數(shù)目減少且不外露, 每個花藥只有2個藥室, 部分花藥退化為膜狀并在其末端形成絲狀物; 1% I2-KI染色發(fā)現(xiàn)花藥中含有能正常著色的花粉粒, 與野生型花粉鏡檢不同之處在于總花粉粒數(shù)目的減少; 突變體雌穗花絲增多, 成熟果穗的籽粒兩側(cè)各有1個敗育的籽粒。通過與自交系Mo17雜交得到F1完全正常。利用F2分離群體進行遺傳分析發(fā)現(xiàn)突變表型由隱性單基因控制。利用BSA法, 初步將該基因定位在3號染色體長臂上。隨后利用29對SSR標記和10對Indel標記, 將突變基因定位到S-6和umc1027兩個標記之間, 物理距離為1.5 cM。該定位區(qū)間內(nèi)有21個候選基因, 通過轉(zhuǎn)座子標簽法及測序分析, 最終發(fā)現(xiàn)()基因ATG上游30 bp處發(fā)生了轉(zhuǎn)座子的插入突變。分析表明,與之前所報道的由于堿基突變造成的突變體的突變方式不同, 是一個新的的等位突變體。RT-PCR分析表明基因在突變體中表達量降低。的發(fā)現(xiàn)為玉米花器官發(fā)育研究以及不育化雜交制種提供了新材料。

玉米; 雄性不育; 基因定位; 遺傳分析

植物雄性不育是指雄性器官不能正常發(fā)育, 產(chǎn)生功能異常的雄配子, 但雌性器官能夠正常發(fā)育, 可以與其他有功能的雄配子受精結(jié)實, 且植株不育性能夠穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象。很多原因都會導(dǎo)致雄性不育現(xiàn)象的產(chǎn)生, 如基因漂移、基因突變、光照周期及溫度的改變等[1]。雄性不育按照遺傳方式的不同, 可以分為3類: 細胞質(zhì)雄性不育、細胞核雄性不育以及核質(zhì)互作雄性不育, 其中細胞核雄性不育還分為顯性核不育和隱形核不育, 且以后者為主。

花器官作為高等植物的主要特征, 其發(fā)育模型由經(jīng)典ABC模型逐步完善為之后的ABCD模型、ABCDE模型及四因子模型。玉米具有2類單性花序, 雄穗和雌穗作為成熟花的基本單位分別位于頂生花序和側(cè)生花序上[2]。目前在玉米中已經(jīng)鑒定出多個花器官發(fā)育突變體, 這些突變體對玉米花器官發(fā)育機理的研究、遺傳育種的應(yīng)用和提高雜種優(yōu)勢利用效率具有重要價值。玉米中B類基因有()、、/()、和[3]。是擬南芥同源基因, 它在花藥和漿片原基中表達, 在突變體中心皮替代雄蕊, 稃狀結(jié)構(gòu)替代漿片[4]。、、和是擬南芥同源基因。()突變體的雄穗及漿片轉(zhuǎn)化為內(nèi)外稃結(jié)構(gòu), 同時本應(yīng)在雌穗發(fā)育過程中退化的雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致雌穗花絲增多。

通過創(chuàng)制玉米雄性不育系對大程度的降低人工成本、提高作物育種效率及種子純度具有重要意義。本研究在B73與::突變體雜交后代中篩選得到1個雄性不育突變體, 針對該突變體進行遺傳分析及基因定位, 并進一步對該突變體在雜種優(yōu)勢中的利用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括玉米自交系B73、Mo17和::突變體(美國玉米種質(zhì)中心引進)。以B73與::突變體雜交, 雜交后代經(jīng)多代自交篩選得到雄性不育突變體, 將該不育材料命名為雄性不育系。上述材料均種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗基地。

1.2 突變體的表型鑒定和遺傳分析

野生型和突變體的表型調(diào)查情況如下: 散粉情況在雄穗開花后第2天上午9:00—12:00進行統(tǒng)計, 并根據(jù)散粉能力分為4個等級(0級, 不散粉; 1級, 少量散粉; 2級, 較多散粉; 3級, 正常散粉); 花藥外露在雄穗開花結(jié)束后進行調(diào)查(突變體植株, 在其雌穗吐絲2~3 d后進行統(tǒng)計), 根據(jù)花藥外露情況分為4個等級(0級, 不外露; 1級, 外露少于1/2; 2級, 外露多余1/2; 3級, 全部外露); 部分植株花藥退化形成絲狀突出物, 對雄穗上有絲狀突出物的植株進行統(tǒng)計; 采用1% I2-KI對花粉染色進行育性調(diào)查, 每株重復(fù)3次; 取雄穗中部小穗, 剝離上位花花藥, 用卡諾氏固定液固定, 送拜意爾生物公司進行花藥切片觀察。

以為母本, Mo17為父本, 雜交得到F1代, F1自交獲得F2分離群體。對F2群體進行遺傳分析, 在散粉期調(diào)查各單株表型, 統(tǒng)計各群體總株數(shù)、可育株數(shù)及不育株數(shù), 利用卡方測驗分析遺傳模式。

1.3 目的基因初定位

構(gòu)建的F2群體中于散粉期分別選取30株可育株和不育株, 提取DNA用于構(gòu)建“野生型池”和“突變體池”, 利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法對進行初定位。根據(jù)定位結(jié)果在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org/)中選取多對的SSR標記(表1), 另外12份可育株和不育株組成的“野生型池”和“突變體池”進行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 進行SSR標記多態(tài)性篩選及突變位點定位。

1.4 DNA的提取、分子標記的開發(fā)及候選基因預(yù)測

在抽雄前完成對親本和分離群體取樣, CTAB法提取植株DNA[6]。待散粉結(jié)束完成育性調(diào)查后, 用于基因定位。根據(jù)初步定位結(jié)果, 在MaizeGDB上下載B73參考基因組序列, 用Blast與Mo17序列進行比對, 找出單拷貝區(qū)段中有InDel差異的位點, 根據(jù)這些差異位點設(shè)計顯性標記(表1), 來源于Mo17的序列可以擴增出產(chǎn)物, 而來源于B73的序列則不能, 再通過瓊脂糖凝膠電泳來篩選交換單株, 并通過標記加密進一步縮小定位區(qū)間。

由于該突變表型是轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座造成插入突變導(dǎo)致, 且大多數(shù)轉(zhuǎn)座子末端包含反向重復(fù)序列, 因此利用轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列來設(shè)計引物[7], 通過該引物與候選基因特異性引物組合擴增的方法來確定候選基因。

1.5 PCR擴增及序列分析

利用Primer 3在線設(shè)計引物, 由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成引物。PCR反應(yīng)總體積為15 μL, 含2 × PCR Mix 7.5 μL、模板1.5 μL (50 ng μL–1)、引物各1 μL (5 μmol L–1), ddH2O補至15 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性(94℃, 5 min); 變性(94℃, 30 s), 退火(根據(jù)m值而定, 30 s), 延伸(72℃, 1 min), 34個循環(huán); 72℃延伸5 min。

在EnsemblPlants網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org/ index.html)上下載目的基因ATG上游2500 bp序列, 用啟動子元件預(yù)測網(wǎng)站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測目的基因的啟動子區(qū)調(diào)控元件, 對PlantCARE預(yù)測結(jié)果進行分析整理, 再利用TBtools軟件[8]對結(jié)果進行可視化分析。

1.6 RNA提取及表達量分析

取抽雄前雄穗幼穗, 一部分放入液氮中速凍后于-80℃保存, 另外一部分用于表型觀察, 待后期表型和基因型鑒定后, 挑選出相應(yīng)的野生型和突變體提取RNA。參照TRI pure Reagent總RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)操作手冊提取RNA, 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書合成cDNA。采用RT-PCR檢測目的基因在野生型和突變體中的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 mi-ms-3的表型鑒定

突變體植株在營養(yǎng)生長階段與野生型植株無差異; 而在生殖生長階段, 突變體植株雖能正常抽雄, 但花藥基本不外露(圖1-A)。肉眼及花藥石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn), 突變體花藥瘦小, 只有2個藥室, 其余2個藥室退化(圖1-B1, B2)。突變體雄穗花藥數(shù)目與野生型相比, 下位花無花藥,上位花有0~3數(shù)目不等的花藥, 部分花藥退化為膜狀, 并在其末端形成絲狀物(圖1-C1~C4)。1% I2-KI染色發(fā)現(xiàn), 突變體花藥中包含花粉, 且花粉粒能正常著色(圖1-D1, D2), 但花藥不開裂、不散粉。與野生型植株雌穗相比, 突變體雌穗在開花期表現(xiàn)為花絲增多, 每個子房對應(yīng)2~4個花絲(圖1-E1, E2); 授粉后, 突變體成熟果穗的籽粒兩側(cè)存在敗育的籽粒。

表1 基因定位及基因表達分析的引物

圖1 mi-ms-3和野生型表型

A: 野生型(左)和(右)雄穗表型,花藥不外露; B1~B2: 花藥發(fā)育后期, 野生型和花藥橫切片,花藥只有2個藥室; C1~C4:突變體小穗, 分別包含0~3個花藥; D1~D2: 野生型和花粉粒; E1:(左)和野生型(右)雌穗表型,雌穗花絲增多; E2:(左)和野生型(右)籽粒表型,每個籽粒對應(yīng)多個花絲。

A: the tassel of WT(wild type) (left) and(right),anther not exserted; B1–B2: transverse sections of the entire anther of WT andin the late microspore developmental stage,anthers with only two pollen sacs; C1–C4: the spikelet ofcontain 0–3 anthers respectively; D1–D2: pollen grains of WT and; E1: the ear of(left) and WT (right), the number of silks in the ear of theincreased; E2: the kernel of(left) and WT (right),each seed corresponds to multiple silks.

2.2 mi-ms-3的遺傳分析

通過對突變體與Mo17雜交得到的F2分離群體進行遺傳分析發(fā)現(xiàn), F1代雄穗與雌穗均表現(xiàn)正常, F2群體野生型和突變體單株分別為73株和30株, 符合3﹕1 (c2= 0.94,= 0.33), 說明該突變表型是由隱性單基因控制。

2.3 突變基因的定位和克隆

利用本實驗室已合成的全基因組SSR引物對構(gòu)建的2個極端混池進行擴增, 篩選多態(tài)性標記, 并初步將目的基因定位在3號染色體長臂上。根據(jù)育性調(diào)查結(jié)果, 在F2群體中隨機選取野生型和突變體各12株, 構(gòu)成另一組混池。在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中選取29對SSR標記在“野生型池”和“突變體池”之間進行多態(tài)性標記篩選。對聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析發(fā)現(xiàn), 其中8對SSR標記在“野生型池”和“突變體池”中具有多態(tài)性, 用這8對SSR標記對分離群體進行檢測, 初步將目的基因定位在 umc1973和umc1027兩個SSR標記之間, 物理距離為5.9 Mb。

為了進一步精細定位, 根據(jù)B73和Mo17參考基因組在umc1973和umc1027兩個標記間的序列差異開發(fā)InDel標記, 并對2個親本進行多態(tài)性分析, 共篩選出10對Indel標記(表1), 最終將候選基因定位到S-6和umc1027兩個標記之間, 物理距離為1.5 cM (表2)。對定位區(qū)間內(nèi)的21個基因進行分析, 根據(jù)基因表達模式, 選擇在花藥中表達量較高的基因作為候選基因, 包括、、、和。根據(jù)轉(zhuǎn)座子標簽法, 通過利用轉(zhuǎn)座子末端反向重復(fù)序列設(shè)計的引物TIR-1與候選基因特異性引物42618-R組合進行PCR擴增,最終確定發(fā)生插入突變的基因為(圖2), 該基因編碼MADS-box蛋白, 是參與花器官發(fā)育模型的B類功能基因。通過對野生型和突變體中該基因全長擴增比對發(fā)現(xiàn), 突變體中該基因擴增片段長度要比野生型長。測序分析表明, 在基因起始密碼子ATG上游30 bp處有1494 bp序列插入, 在插入位點處形成9 bp靶位點重復(fù)(TTCCTTGGG) (圖3)。對1494 bp序列進行分析發(fā)現(xiàn), 其為1個完整的轉(zhuǎn)座子, 該轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)座活性。

表2 重要重組單株基因型及表型

H表示雜合基因型; A表示突變體基因型。

H denotes the heterozygosity genotype; A denotes the genotype of mutant.

圖2 Mu轉(zhuǎn)座子插入突變體的鑒定

1~2: 雜合野生型植株; 3~5: 純合野生型植株; 6: marker; 7~14: 純合突變體植株; 15: B73; 16: Mo17。

1–2: heterozygous plants; 3–5: homozygous wild type plants; 6: marker; 7–14: homozygous mutant plants; 15: B73; 16: Mo17.

2.4 zmm16的啟動子分析

啟動子預(yù)測分析結(jié)果顯示,基因的啟動子區(qū)包括茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、參與防御和應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、干旱脅迫響應(yīng)元件及厭氧響應(yīng)元件(圖4)。研究表明, 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件與玉米雄穗和雌穗的發(fā)育有關(guān)[9], 特別是與玉米單性花形成密切相關(guān)[10]。除此之外,基因啟動子區(qū)還存在與分生組織表達相關(guān)的順式作用元件, 這也進一步說明轉(zhuǎn)座子插入是導(dǎo)致花藥發(fā)育異常的原因。另外, 還發(fā)現(xiàn)低溫響應(yīng)順式作用元件及多個光響應(yīng)元件, 這2類響應(yīng)元件對玉米基因功能的影響值得在未來深入探討。

圖3 zmm16基因序列分析

轉(zhuǎn)座子插入到基因ATG上游30 bp處。transposon occurred at 30 bp upstream of ATG of.

圖4 zmm16啟動子元件預(yù)測分析

2.5 zmm16表達量分析

分別取突變體和野生型幼穗各3株提取RNA, 進行RT-PCR。結(jié)果表明,中基因表達量降低。這說明轉(zhuǎn)座子的插入突變并非導(dǎo)致完全不表達, 這一結(jié)果也對應(yīng)了突變體中花藥未完全退化的表型(圖5)。

圖5 zmm16表達量分析

相對于野生型,中基因表達量降低。

The expression ofindecreased compared with wild type.

3 討論

與模式植物擬南芥相比, 玉米基因組更為復(fù)雜, 是擬南芥的幾十倍。BSA法能夠快速高效獲得與目的基因連鎖的分子標記, 發(fā)掘更多控制作物農(nóng)藝性狀的遺傳位點。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)了一個玉米雌穗無花絲突變體, 利用BSA法篩選到與目的基因連鎖的2個SSR標記umc1555和umc1448, 并通過精細定位及序列分析, 確定目的基因為。Sun等[12]通過BSA與測序技術(shù)相結(jié)合的方法定位到水稻耐冷性相關(guān)基因的候選區(qū)間, 并進一步通過GO分析確定了的候選基因。當轉(zhuǎn)座子插入到功能基因內(nèi)部或基因附近后能夠破壞基因的功能從而產(chǎn)生突變表型。轉(zhuǎn)座子均具有約220 bp保守末端反向重復(fù)序列[13], 因此,可作為插入標簽用以進行基因定位。根據(jù)TIRs序列設(shè)計引物, 當轉(zhuǎn)座子插入到某一基因后產(chǎn)生插入突變, 通過突變表型的篩選以及TIRs相關(guān)引物, 分離得到插入位點側(cè)翼序列, 進而獲得基因序列。Wang等[14]利用定位區(qū)間內(nèi)25個候選基因的特異性引物與TIR引物組合擴增的方法, 成功克隆到一個雄性不育基因, 它編碼一個半乳糖基轉(zhuǎn)移酶, 主要在花藥表皮和絨氈層中表達。Cui等[15]通過基因特異性引物和TIR引物組合擴增及測序的方法, 鑒定了四個等位基因插入的轉(zhuǎn)座子的種類及其插入位點。本研究采用BSA結(jié)合轉(zhuǎn)座子標簽法的定位策略, 成功定位到突變基因。BSA能夠快速找到與目的基因連鎖的分子標記, 使從整個基因組上定位突變基因更為快速。相較于通過測序來確定突變基因的方法, 轉(zhuǎn)座子標簽法的利用可以直接通過PCR確定目的基因, 降低了試驗成本。

Bartlett等[5]利用BSA法將基因定位到3號染色體長臂上, 并發(fā)現(xiàn)突變表型與umc1266完全連鎖, 根據(jù)突變體表型推定該基因?qū)儆贐類基因, 在umc1266標記3.39 Mb處發(fā)現(xiàn)1個B類基因, 測序發(fā)現(xiàn)突變體第3內(nèi)含子上G突變?yōu)锳,突變體第4內(nèi)含子上G突變?yōu)锳, 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本不能發(fā)生正常剪接, 影響基因轉(zhuǎn)錄過程, 造成雄花不育, 花藥完全退化為膜狀結(jié)構(gòu), 雌花可育, 花絲增多。本研究獲得了一個新的等位突變體, 該突變體表型與相似, 但相對于花藥完全退化,則表現(xiàn)為部分花藥未完全退化, 雄穗上部分小穗含有花藥, 與野生型植株花藥不同之處在于的花藥只有2個藥室, 同時雄穗上其他部分花藥退化為膜狀并在其末端形成絲狀物。在突變體中,內(nèi)含子發(fā)生點突變, 轉(zhuǎn)錄本不能進行正常剪接, 產(chǎn)生不完整的轉(zhuǎn)錄本, 導(dǎo)致基因功能缺失。而突變表型是由轉(zhuǎn)座子的插入突變造成的。取雄穗進行表達量分析發(fā)現(xiàn),突變體基因的表達量下降而非完全不表達, 這一突變表現(xiàn)為滲漏突變, 即基因編碼的蛋白功能不完全失活, 仍然保留了一些功能。與相同之處在于,不育基因也與雌穗多花絲的標記性狀[16]連鎖,在開花期也表現(xiàn)為雌穗花絲增多, 每個子房對應(yīng)2~4個花絲, 成熟果穗籽?；坑袛∮N子。

高等植物的基因轉(zhuǎn)錄起始位點一般位于起始密碼子(ATG)上游-40~-70 bp處。一般而言, 轉(zhuǎn)錄起始位點的缺失會影響轉(zhuǎn)錄, 但是也有學(xué)者認為轉(zhuǎn)錄位點并不是轉(zhuǎn)錄發(fā)生所必須的[17]。植物啟動子中含有許多順式作用元件, 通過轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合來調(diào)控基因表達, 進而影響植物的生長發(fā)育過程。研究表明, MADS-box蛋白能與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件特異性結(jié)合, 使靶基因在特定的時間和空間以特定的強度表達[18]。中插入到基因上游, 可能導(dǎo)致基因編碼蛋白不能與啟動子區(qū)順式作用元件結(jié)合來調(diào)控基因的表達, 而以一種低表達量的狀態(tài)體現(xiàn)在突變體雄穗中部分小穗含有花藥的表型上?；騿幼有蛄兄写嬖诘蜏仨憫?yīng)元件及大量光響應(yīng)元件, 這說明其表達可能受溫度和光照環(huán)境因素的影響。在花藥發(fā)育的特定階段, 通過調(diào)節(jié)基因表達來適應(yīng)一定范圍內(nèi)的光、溫等環(huán)境變化。對玉米基因啟動子區(qū)進行初步分析, 為將來進行基因功能的驗證奠定了基礎(chǔ)。

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Genetic analysis and characterization of male sterile mutantin maize

TIAN Shi-Ke, QIN Xin-Er, ZHANG Wen-Liang, DONG Xue, DAI Ming-Qiu, and YUE Bing*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Maize is one of the best crops in the utilization of heterosis. Male sterile lines are important germplasms for the hybrids production. A male sterile mutant namedwas obtained by screening in a mutator insertion library. The number of male anthers in tassel decreased and not exserted. There were few anthers with only two pollen sacs in the mutant tassels, and some of the anthers were degenerated to membranous and formed filaments at their ends. Although pollens in the anthers could be stained by I2-KI, pollen shedding was abnormal and the number of pollen grains decreased. The number of silks in the ear of the mutant increased, and there was a sterile grain on both sides of the maturated kernel. Fertility of F1plants, which were obtained by hybridization betweenand maize inbred Mo17, was normal. Genetic analysis of F2population showed that the mutant phenotype was controlled by a recessive gene. The candidate gene was preliminarily mapped on the long arm of chromosome 3 by BSA and it was located between a SSR marker and an Indel marker with a distance of 1.5 cM. There are 21 candidate genes in this region. It was finally found that the insertion mutation oftransposon occurred at 30 bp upstream of the coding region of() by transponson tagging and sequencing analysis. The results showed thatwas a new allele of, which caused by a single base mutation in the coding region. RT-PCR analysis indicated that the expression ofin the mutant was decreased. The identification of the new allelic mutant ofin this study would provide new materials for the study of flower development and hybrid seed production.

maize; male sterile; gene mapping; genetic analysis

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100804)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100804).

岳兵, E-mail: yuebing@mail.hzau.edu.cn

E-mail: tianshike1996@163.com

2020-05-07;

2020-08-19;

2020-08-31.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200828.1751.009.html

10.3724/SP.J.1006.2020.03025