親本規(guī)格對(duì)中華絨螯蟹生殖性能和胚胎質(zhì)量的影響

石今朝,姜曉東，劉乃更,成永旭，吳旭干

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；4.盤錦光合蟹業(yè)有限公司,遼寧盤錦 124200)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis,以下簡(jiǎn)稱河蟹)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，具有重要的養(yǎng)殖價(jià)值和食用價(jià)值[1]。河蟹人工養(yǎng)殖一般分為三個(gè)階段，即幼體繁育階段(初孵幼體至大眼幼體)、扣蟹養(yǎng)殖階段(大眼幼體至扣蟹)和成蟹養(yǎng)殖階段(扣蟹至成蟹)。自20世紀(jì)80年代初我國(guó)突破河蟹蟹苗人工繁育的關(guān)鍵技術(shù)以來，蟹苗生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，蟹苗產(chǎn)量從1997年的65.00 t左右增加至2017年的843.89 t，并表現(xiàn)出進(jìn)一步的增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。

科研人員和養(yǎng)殖戶一直致力于河蟹親本的有效管理及幼體繁育技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用。研究表明，河蟹胚胎質(zhì)量直接影響著初孵幼體的質(zhì)量[3-4]。而胚胎的質(zhì)量取決于親本優(yōu)劣,Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)給河蟹親本投喂含磷脂和中性脂高的餌料其胚胎孵化出的初孵幼體的頭胸甲長(zhǎng)和饑餓狀態(tài)下的存活天數(shù)均顯著高于對(duì)照組。此外，有學(xué)者認(rèn)為部分育苗場(chǎng)為了降低育苗成本而使用小規(guī)格商品蟹作為親本所繁育的子代養(yǎng)殖性狀低劣，混入市場(chǎng)后易導(dǎo)致河蟹種質(zhì)資源退化[6]。與之相反，大規(guī)格親本所產(chǎn)幼體生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，但大規(guī)格親本收購(gòu)成本較高，且大規(guī)格抱卵蟹具有越冬成活率低和抱卵率不穩(wěn)定等缺陷，往往給育苗生產(chǎn)者帶來經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。因此，出于對(duì)蟹苗繁育成本及最終收益的考慮如何挑選規(guī)格合適的親本成為繁育場(chǎng)關(guān)注的重點(diǎn)問題。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)不同規(guī)格甲殼動(dòng)物的繁殖性能差異已有一定程度的研究，普遍認(rèn)為親本規(guī)格與其產(chǎn)卵量呈明顯正相關(guān)[9-11]。河蟹作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，有關(guān)其親本規(guī)格與生殖性能關(guān)系的研究目前尚未見報(bào)道，雖蟹苗繁育過程中往往根據(jù)親本規(guī)格及卵塊大小估計(jì)其抱卵量，但缺少科學(xué)的量化指標(biāo)。河蟹產(chǎn)卵后將其粘附于腹部，隨母體進(jìn)行卵內(nèi)發(fā)育直至 Ⅰ 期溞狀幼體后再將其排入水中，在此期間部分胚胎易因外界環(huán)境刺激而脫落甚至流產(chǎn)，為此本實(shí)驗(yàn)以臨排幼之前的抱卵蟹為研究對(duì)象，探索親本規(guī)格與其繁殖性能之間關(guān)系，以期進(jìn)一步了解河蟹的繁殖生物學(xué)，為苗種生產(chǎn)過程中親蟹的選擇及育苗產(chǎn)量的估計(jì)提供理論參考 。

1 材料和方法

1.1 親本來源及交配

河蟹親本于2018年11月采自常州市金壇水產(chǎn)站河蟹養(yǎng)殖基地，均為經(jīng)過育肥的二齡長(zhǎng)江水系池塘養(yǎng)殖河蟹成體，其中母本體重為50～250 g，父本體重為80～300 g，實(shí)驗(yàn)用親本均為肢體健全和有活力的個(gè)體。親本活體運(yùn)輸至上海海洋大學(xué)如東河蟹遺傳育種中心后，根據(jù)體質(zhì)量將親本分為四個(gè)等級(jí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，A：雌體50～80 g+雄體80～120 g；B：雌體100～130 g+雄體130～180 g；C：雌體150～180 g+雄體200～250 g；D：雌體200～240 g+雄體250～330 g，每組均挑選60只雌體和30只雄體；將各規(guī)格親本分別放入四只條件相似的實(shí)驗(yàn)池塘(長(zhǎng)×寬×深=14 m×11 m×2 m)中，池內(nèi)海水鹽度為18%左右，池四周設(shè)有防逃圍網(wǎng)。親本入池兩天后開始投喂冰鮮帶魚，日投喂量為親本體重的2%～5%，具體根據(jù)食臺(tái)殘餌和水溫情況靈活調(diào)整。

2019 年 1 月中旬排干池塘水體，剔除交配池內(nèi)所有雄蟹，同時(shí)檢查雌蟹的抱卵情況，各組雌蟹的抱卵率均超過90%。由于河蟹冬季在池塘中有挖穴越冬的習(xí)性，因此需要認(rèn)真檢查和移除池塘所有洞穴內(nèi)中的雄蟹。剔除雄蟹后，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)池塘中分別加入海水后，讓抱卵蟹在室外土池中自然越冬。根據(jù)河蟹的繁殖習(xí)性和對(duì)環(huán)境的要求，抱卵蟹越冬期間池塘水位要保持1.5 m以上，以確保池底環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。

1.2 樣品采集及生殖性能統(tǒng)計(jì)

2019年4月20日左右，從種蟹池隨機(jī)挑選不同規(guī)格的抱卵蟹，抱卵蟹胚胎心跳均為100～150次/min，每個(gè)親本規(guī)格均選擇至少8只進(jìn)行生殖性能研究。采樣抱卵蟹，首先用鑷子取出雌體腹部的所有卵塊，進(jìn)一步剔除卵塊中的攜卵附肢，然后采用電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，精確度為0.01 g)精確稱取卵塊重量(不含有攜卵附肢)和剔除卵后的雌體體質(zhì)量(不含腹部卵塊)，雌體親本去卵后平均體重和數(shù)量見表1。隨后用游標(biāo)卡尺(上海精美量具廠，精度0.01 mm)測(cè)量雌體殼長(zhǎng)和殼寬。精確計(jì)數(shù)0.1 g左右卵塊中的胚胎的數(shù)量，參照吳旭干等[12]的方法計(jì)算抱卵量、生殖力和生殖指數(shù)，計(jì)算公式如下：

PE=W/SWW

F=PE/WB

ER=100%×W/WB

公式中：PE為抱卵量(萬/只)；W為抱卵蟹的卵塊濕重(g)；SWW為單個(gè)胚胎濕重(g)；F為生殖力(個(gè)胚胎/克親本體重)；ER為生殖指數(shù)(%)；WB為抱卵蟹凈體質(zhì)量(g,去卵后的質(zhì)量)；

表1 不同規(guī)格河蟹親本的平均體重及采集數(shù)量Tab.1 Mean body weight and amount of Chinese mitten crab broodstock

1.3 胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)

在OLYMPUS顯微鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量胚胎直徑(精確到10 μm)，每只抱卵蟹測(cè)量100個(gè)胚胎。取胚胎3～4 mg(濕重)裝入錫箔稱量杯，用百萬分之一天平準(zhǔn)確稱量總重，胚胎稱重前需用碳酸氫氨等滲液沖洗和吸干表面水分，每只抱卵蟹重復(fù)測(cè)定3次，將稱重后的濕胚胎和錫箔稱量杯放入70度烘箱中烘干24 h，在干燥皿中冷卻20 min左右精確稱重[13]。將烘干的胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，可用蒸餾水或70 ℃酒精沾濕后，精確計(jì)算胚胎數(shù)量。然后，計(jì)算單個(gè)胚胎干重和單個(gè)胚胎濕重，計(jì)算方法如下：

SWW=WW/N

SDW=WD/N

式中：SWW代表單個(gè)胚胎濕重(μg)；WW代表稱取的胚胎的濕重(μg)；N代表胚胎數(shù)量(個(gè))；SDW代表單個(gè)胚胎的干重(μg)；WD代表稱取的胚胎烘干后的質(zhì)量(μg)；

按照AOAC[14]標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定胚胎粗蛋白和灰分含量。采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量，在550 ℃下灼燒至恒重測(cè)定灰分含量；按照Folch等[15]的方法采用氯仿 ∶甲醇(V/V=2 ∶1)提取總脂并測(cè)定其含量；水分測(cè)定采用冷凍干燥法測(cè)定。

1.4 回歸分析及數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件繪制親本規(guī)格與生殖性能的關(guān)系曲線。采用SPSS 24軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足齊性方差時(shí)對(duì)百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根處理，采用 ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用Tukey’ s-b(K)法進(jìn)行多重比較；當(dāng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后仍不滿足齊性方差時(shí)，采用Games-Howell進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，取P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 生殖性能差異

由表2知，隨著親本規(guī)格的增加，親本抱卵量呈顯著上升趨勢(shì)；與之相反，親本生殖力和生殖指數(shù)隨著親本的規(guī)格的增加而呈下降趨勢(shì)，且其中僅A組親本的生殖力和生殖指數(shù)顯著較高。

表2 不同規(guī)格河蟹親本繁殖性能差異Tab.2 Reproductive performance of Chinese mitten crab broodstock with different body weights

2.2 胚胎質(zhì)量

表3顯示：A組親本的胚胎直徑稍高于另外三組(5.30%～6.95%)，但各組間無顯著差異；此外，不同規(guī)格河蟹親本的單個(gè)胚胎濕重和單個(gè)胚胎干重分別為62.50 μg和11.35 μg左右，且各組間同樣無顯著差異。

表3 不同規(guī)格河蟹親本胚胎直徑和胚胎重差異Tab.3 Embryp diameter and weight of Chinese mitten crab broodstock with different body weights

各組蟹胚胎基于干重的常規(guī)生化組成如表4所示。 C組蟹胚胎水分含量顯著低于另外三組，此外，A組粗蛋白和灰分含量均高于另外三組，其中A組粗蛋白含量與B、C兩組差異顯著。不同規(guī)格親本所產(chǎn)蟹胚胎的總脂含量差異較小，均為18.00%左右。

表4 不同規(guī)格抱卵蟹的蟹胚胎常規(guī)生化成分比較Tab.4 Proximate composition of embryo of Chinese mitten crab broodstock with different body weights %干重

2.3 回歸分析

所有實(shí)驗(yàn)親本產(chǎn)卵量、生殖力和生殖指數(shù)與其體重、殼長(zhǎng)和殼寬的回歸分析結(jié)果如圖1所示。圖1中編號(hào)a、b、c所示的回歸曲線為親本體重與抱卵量、生殖力和生殖指數(shù)的關(guān)系，隨著河蟹親本體重的增加抱卵量呈快速上升趨勢(shì)，大規(guī)格親本的抱卵量明顯高于小規(guī)格親本的抱卵量，200 g左右親本的抱卵量甚至能達(dá)到50 g左右親本的抱卵量的3～4倍以上，然而，隨著親本體重的增加，親本的生殖力和生殖指數(shù)顯現(xiàn)出下降趨勢(shì)。編號(hào)d～i分別是殼長(zhǎng)、殼寬與抱卵量、生殖力、生殖指數(shù)的關(guān)系，隨著親本殼長(zhǎng)與殼寬的增加，親本的抱卵量明顯增加，其生殖力和生殖指數(shù)呈下降趨勢(shì)。從回歸分析結(jié)果看，抱卵量與體重、殼長(zhǎng)和殼寬的相關(guān)系數(shù)分別為0.72、0.74和0.73，生殖力與親本體重、殼長(zhǎng)和殼寬的相關(guān)系數(shù)分別為0.25、0.23和0.23，生殖指數(shù)與親本體重、殼長(zhǎng)和殼寬的相關(guān)系數(shù)分別為0.26、0.23和0.23。

圖1 中華絨螯蟹體重、殼長(zhǎng)和殼寬與生殖性能之間的關(guān)系Fig.1 Scatter plots of the relationships between broodstock size(body weight,carapace length and carapace width) and reproductive performance of Chinese mitten craba.體重與抱卵量；b.體重與生殖力；c.體重與生殖指數(shù)；d.殼長(zhǎng)與抱卵量；e.殼長(zhǎng)與生殖力；f.殼長(zhǎng)與生殖指數(shù)；g.殼寬與抱卵量；h.殼寬與生殖力；i.殼寬與生殖指數(shù)

3 討論

3.1 生殖性能差異

研究表明，甲殼動(dòng)物親本的生殖性能主要受到親本營(yíng)養(yǎng)狀況、配對(duì)環(huán)境和產(chǎn)卵次數(shù)的影響[16-18]。本試驗(yàn)中所有親本均為第1次抱卵，且均在相同的環(huán)境下交配、育肥及產(chǎn)卵，排除了抱卵次數(shù)、營(yíng)養(yǎng)狀況和環(huán)境因素對(duì)親本的影響，因此可以在一定程度上反映親本規(guī)格與生殖性能的關(guān)系。產(chǎn)卵量是評(píng)估甲殼動(dòng)物生殖性能的重要指標(biāo)，除部分生長(zhǎng)過程中產(chǎn)卵多次的蝦類外，甲殼動(dòng)物產(chǎn)卵量一般隨著體質(zhì)量的增加而明顯增加，該現(xiàn)象在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)[19]。生殖力指單位體重甲殼動(dòng)物的產(chǎn)卵量，生殖指數(shù)指單位體重甲殼動(dòng)物的卵塊重，本研究中抱卵蟹的生殖力和生殖指數(shù)均隨著親本體質(zhì)量的增加而下降，這可能與大規(guī)格河蟹親本完成生殖蛻殼的時(shí)間晚性腺發(fā)育時(shí)間短有關(guān)，從而在繁育階段表現(xiàn)為較低的生殖力和生殖指數(shù)[20]。此外，常國(guó)亮等[21]在研究小規(guī)格早熟河蟹的性腺指數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)小規(guī)格河蟹雄蟹的性腺指數(shù)顯著高于大規(guī)格正常成熟的雄蟹，推測(cè)這種現(xiàn)象與河蟹生長(zhǎng)發(fā)育過程中的營(yíng)養(yǎng)過剩有關(guān)。小規(guī)格河蟹具有更高的生殖力的原因也可能是其在進(jìn)行蛻殼和生長(zhǎng)時(shí)消耗的營(yíng)養(yǎng)較少，在生殖生長(zhǎng)時(shí)可以將更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于性腺的發(fā)育。

本研究中不同規(guī)格親本的胚胎直徑、干重和濕重均差異較小。結(jié)合之前研究中親本營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)胚胎質(zhì)量影響較小的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，河蟹胚胎的重量和規(guī)格具有很強(qiáng)的保守性[12,22]。蛋白質(zhì)和脂類是甲殼類胚胎發(fā)育過程中重要的能源物質(zhì)，因此對(duì)胚胎生化組成的研究可以了解個(gè)體或組織對(duì)能源物質(zhì)的儲(chǔ)存和利用情況[23-24]。本研究中A組親本(50～80 g)胚胎中粗蛋白明顯高于其余各組，可以為胚胎發(fā)育以及幼體出膜提供更多能量。之前的研究表明胚胎中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量主要受到產(chǎn)卵前母本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累程度和胚胎發(fā)育過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的影響[25]，由此可見本實(shí)驗(yàn)中小規(guī)格母本在產(chǎn)卵前可能積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，這與Wang等[26]在比較不同規(guī)格河蟹雄體營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)實(shí)驗(yàn)中小規(guī)格個(gè)體性腺營(yíng)養(yǎng)積累最為豐富的結(jié)果相一致。此外，蛋白質(zhì)和脂類同樣也作為河蟹初孵幼體的能量來源，并且蛋白質(zhì)同時(shí)也是組成組織和器官的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)[3]，但是在實(shí)際生產(chǎn)中因大規(guī)格親本本身所具備的優(yōu)良形狀且尚沒有證據(jù)表明小規(guī)格親本所產(chǎn)幼體的質(zhì)量?jī)?yōu)于大規(guī)格親本，繁殖場(chǎng)仍傾向于使用大規(guī)格親本繁育苗種。本實(shí)驗(yàn)中不同規(guī)格親本所產(chǎn)幼體的質(zhì)量是否會(huì)因?yàn)榕咛ブ械鞍缀坎町惗瑯哟嬖诓町?，仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 回歸分析

在蝦蟹類的繁育中，往往很難直接測(cè)定其抱卵量，如何預(yù)測(cè)抱卵量則具有一定的應(yīng)用價(jià)值。目前，普遍采用的方法是先建立雌蟹抱卵數(shù)量與體質(zhì)量、殼寬或殼長(zhǎng)等形態(tài)參數(shù)的數(shù)學(xué)關(guān)系式，而后只需要測(cè)量該蟹類相應(yīng)的形態(tài)參數(shù)便可以計(jì)算出其抱卵數(shù)量。至今有關(guān)河蟹產(chǎn)卵量預(yù)測(cè)的研究尚無報(bào)道，但對(duì)于同屬于甲殼蟹類的梭子蟹科的研究相對(duì)較多[27-29]。在本實(shí)驗(yàn)的回歸分析的結(jié)果中顯示，親本抱卵量與其體重、殼長(zhǎng)和殼寬均呈指數(shù)正相關(guān)，而親本生殖力和生殖指數(shù)與其體重、殼長(zhǎng)和殼寬成冪函數(shù)負(fù)相關(guān)，這與之前在部分甲殼動(dòng)物上的研究結(jié)果相一致[29-30]。但這種線性關(guān)系也不是絕對(duì)的，李玉全等[31]和王仁杰等[32]研究表明三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)親本體重與排幼量呈顯著線性相關(guān)，而顏慧等[33]觀察發(fā)現(xiàn)日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的生殖力與體重和體長(zhǎng)無明顯的相關(guān)性，由此可見，不同學(xué)者建立的甲殼類生物學(xué)指標(biāo)與抱卵量關(guān)系式不一樣，表明建立關(guān)系式時(shí)所取樣本的數(shù)量、大小、地域、時(shí)間等因素，以及試驗(yàn)操作均會(huì)影響抱卵量的最終預(yù)測(cè)。因此，在進(jìn)行回歸相關(guān)關(guān)系研究時(shí)，宜根據(jù)具體對(duì)象所獲得的資料，用不同的函數(shù)類型擬合后，再進(jìn)行比較，擇其最優(yōu)者。

從個(gè)體生殖性能與各生物學(xué)指標(biāo)的回歸方程可以看出，體重、殼長(zhǎng)和殼寬均可以有效反映河蟹的生殖性能。但是對(duì)抱卵蟹稱重不易操作，以體質(zhì)量預(yù)測(cè)抱卵量的操作具有局限性，因此通過頭胸甲寬或頭胸甲長(zhǎng)與抱卵量的回歸方程估計(jì)抱卵量更為方便[28]。此外，河蟹的土池生態(tài)育苗過程中，Z1幼體的布苗密度為30萬只/m3左右，親蟹規(guī)格與產(chǎn)卵量的關(guān)系研究對(duì)于培育土池的需求量估算也具有重要的指導(dǎo)意義。但是幼體繁育過程中存在的部分未發(fā)育或發(fā)育不完全的死卵往往導(dǎo)致親蟹排幼不完全，或部分親蟹排幼過程中死亡致使部分幼體沒有排出，可能會(huì)影響最終布苗密度的估算[34]。

綜上，雖然小規(guī)格親本抱卵量較少，但其生殖力、生殖指數(shù)及胚胎營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存均顯著高于大規(guī)格親本。親本抱卵量與體質(zhì)量、殼長(zhǎng)和殼寬具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.72、0.74和0.73，因此可以通過親本規(guī)格有效估計(jì)不同規(guī)格親本的生殖性能，為生產(chǎn)實(shí)踐中河蟹親本的選擇提供理論參考。關(guān)于不同規(guī)格親本所產(chǎn)幼體的質(zhì)量是否存在差異，尚待進(jìn)一步研究 。