高效液相色譜法在抗生素類藥物殘留中的應(yīng)用

李香霖

新疆伊犁川寧生物技術(shù)有限公司 新疆伊寧 835800

現(xiàn)臨床上抗生素常作為預(yù)防用藥及治療用藥使用，起到抑菌或殺菌作用，但濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)菌群紊亂、免疫系統(tǒng)遭到破壞、細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)內(nèi)臟損傷、嚴(yán)重感染等不良反應(yīng)[1]。本研究在對(duì)《規(guī)范》中測(cè)定6種抗生素和甲硝唑的HPLC方法流動(dòng)相系統(tǒng)等方面進(jìn)行了合并優(yōu)化，采用甲醇和0.1mol/L鹽酸（體積比1：1）提取樣品，使用乙腈-甲酸梯度洗脫系統(tǒng)，在C18色譜柱上對(duì)祛痘類化妝品中6種抗生素和甲硝唑進(jìn)行分離檢測(cè)，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。所建立的方法簡(jiǎn)便可行，科學(xué)準(zhǔn)確；經(jīng)173批次樣品檢測(cè)證明，此方法具有較強(qiáng)的適用性和耐用性。

1 高效液相色譜法簡(jiǎn)介

HPLC本身是色譜法諸多技術(shù)之一，也是代表性的技術(shù)。HPLC也是藥品檢驗(yàn)中的關(guān)鍵方法。主要的運(yùn)作，就是以高壓輸液泵為主要的運(yùn)行設(shè)備，將諸多成分比例不同的混合溶液或者單溶液，形成的流動(dòng)相，借助設(shè)備將其壓進(jìn)固定相的專有色譜柱，注入到樣品里，從而借助流動(dòng)相就會(huì)流入到色譜柱里，在色譜柱里，各種成本就會(huì)得到充分地分離，然后逐漸進(jìn)入到檢測(cè)設(shè)備中。對(duì)成本展開檢測(cè)，對(duì)樣品展開全方位的化學(xué)分析。HPLC最開始在藥品檢驗(yàn)中發(fā)揮出作用，可以追溯到二十世紀(jì)的七十年代，因此從現(xiàn)階段HPLC的應(yīng)用水平上看，還是積累了非常豐富的使用實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可以在應(yīng)對(duì)各種工作狀況時(shí)采取豐富的經(jīng)驗(yàn)措施。HPLC相比于傳統(tǒng)的色譜檢驗(yàn)方法來(lái)看，可以實(shí)現(xiàn)更加固定地藥品檢驗(yàn)，在檢驗(yàn)過(guò)程中，能夠更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)物細(xì)化。

2 試驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司；電子天平BSA224S-CW型與BT125D型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；渦旋混合器，東京理化器械株式會(huì)社；高速離心機(jī)MultifugeX1R，ThermoFisherScientific；超純水機(jī)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。鹽酸美滿霉素（批號(hào)1-QL-98-1，w=97%）、二水土霉素（批號(hào)19-ANR-82-1，w=98%），TRC；甲硝唑（批號(hào)100191-201507，w=100%）、鹽酸四環(huán)素（批號(hào)130488-201604，w=98.4%）、鹽酸金霉素（批號(hào)130489-201403，w=94.1%）、鹽酸多西環(huán)素（批號(hào)130485-201202，w=85.2%）、氯霉素（批號(hào)130555-201203，w=99.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇，色譜純，德國(guó)Merck公司；磷酸，分析純，天津市百世化工有限公司。

2.2 色譜條件

色 譜 柱：PhenomenonLunaC18(4.6mm×250mm×5μm)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)268nm；柱溫30℃；流速1min/mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取上述6種抗生素和甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10mg于棕色容量瓶中，加入適量的0.1mol/L鹽酸溶液溶解后，用甲醇溶解并定容，得各抗生素單標(biāo)儲(chǔ)備液；精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；用甲醇逐級(jí)稀釋配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相選擇

按照《規(guī)范》中檢測(cè)鹽酸美滿霉素等7種組分的方法，采用草酸+甲醇+乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，圖1列出了空白溶劑色譜圖。從中可以發(fā)現(xiàn)，在保留時(shí)間3min處，出現(xiàn)較高的溶劑峰：正峰和負(fù)峰；因草酸中含有C=O鍵，在紫外光波長(zhǎng)210nm處有吸收。同等條件下測(cè)定鹽酸美滿霉素等7種組分的色譜圖，在相應(yīng)保留時(shí)間處溶劑正峰與鹽酸美滿霉素峰部分重疊；雖然調(diào)整流動(dòng)相比例可將溶劑峰與鹽酸美滿霉素峰稍分開，但分離度未達(dá)到1.0，在樣品測(cè)定中易產(chǎn)生假陽(yáng)性判定。

3.2 色譜柱選擇

采用本研究中的系統(tǒng)條件，考察不同色譜柱對(duì)6種抗生素及甲硝唑的分離情況在3種不同色譜柱上鹽酸美滿霉素等7種組分均分離度良好。其中，鹽酸美滿霉素等7種組分保留時(shí)間稍有變化，但出峰順序一致，分離度良好；在色譜柱色譜圖中鹽酸美滿霉素和甲硝唑出峰順序不同，分離度良好；此方法較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可用于鹽酸美滿霉素等7種組分的檢驗(yàn)檢測(cè)[2-3]。

3.3 回收率與精密度

選擇不含6種抗生素和甲硝唑的水、乳、膏、霜四種不同基質(zhì)化妝品各一種，每種取9份，分別加入低（60%）、中（100%）、高（140%）三個(gè)梯度的對(duì)照品，每個(gè)濃度梯度樣品做3份平行樣，作為加標(biāo)回收樣，依本研究建立的方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。不同基質(zhì)中各組分的加樣回收率范圍為96.5%～110.8%，RSD范圍為0.32%～1.85%，表明方法準(zhǔn)確性良好，所選擇的提取方法能較為完全地提取水、乳、膏和霜四種基質(zhì)化妝品中的目標(biāo)組分。