牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測方法研究進展

劉清榮

（山東省諸城市畜牧業(yè)發(fā)展中心 山東濰坊 262200）

牛傳染性鼻氣管炎病毒屬于皰疹病毒I 型，病牛和帶毒牛是主要傳染源，牛傳染性鼻氣管炎病毒可以發(fā)生呼吸道和生殖道傳播，病毒通過胎盤可以發(fā)生垂直傳播。此外，病毒可以在體內(nèi)潛伏在腰、脊神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)，帶毒牛呈潛伏感染狀態(tài)，可以長期帶毒。不同年齡和性別的牛都可以感染病毒，病牛主要臨床表現(xiàn)為鼻氣管炎、腦膜腦炎，孕牛流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，子宮內(nèi)膜炎和乳房炎，腸炎等，牛傳染性鼻氣管炎病毒危害巨大，只有加強牛傳染性鼻氣管炎病毒的實驗室檢測才能有助于疾病的早期診斷和防治，牛傳染性鼻氣管炎病毒的實驗室檢測方法主要有下面幾種。

1 PCR 檢測方法

PCR 方法是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)，通過設(shè)計特異性檢測引物實現(xiàn)核酸片段的體外擴增，是動物疾病檢測特異、敏感、準確的檢測方法。徐娜等[1]建立了牛傳染性鼻氣管炎病毒雙重PCR 檢測方法，該方法根據(jù)GenBank 中公布的牛傳染性鼻氣管炎病毒gE 和gB 基因序列設(shè)計2 對特異性檢測引物，預(yù)期擴增片段大小分別為112 和78bp，該檢測方法特異性強，對牛支原體、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹瀉病毒、巴氏桿菌、牛和羊布魯菌檢測結(jié)果均為陰性，gB 引物最低檢測濃度為2.3×103拷貝/μL，gE 引物最低檢測濃度為2.4×103拷貝/μL，該檢測方法重復(fù)性好，可以用于牛傳染性鼻氣管炎病毒野毒株感染和gE 基因缺失疫苗株的鑒別診斷。

2 熒光定量PCR 檢測方法

熒光定量PCR 是更加敏感特異的PCR 檢測方法，張穎慧等[2]建立了牛傳染性鼻氣管炎病毒恒溫隔絕式熒光PCR 檢測方法，該檢測方法特異性好，對牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒、牛副流感3 型病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛腺病毒3 型、牛冠狀病毒、牛支原體、多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌的檢測為陰性，敏感性高，檢測下限為2.4 拷貝/μL 質(zhì)粒標準品，檢測過程時間短，利用病毒基因組試劑盒僅需1h 就能出結(jié)果，通過對9 個省29 份商品化凍精檢測，牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性率為24%，說明商品化凍精中牛傳染性鼻氣管炎病毒感染率較高，應(yīng)該引起廣泛關(guān)注，該檢測方法可以用于牛傳染性鼻氣管炎病毒的快速檢測。

3 LAMP 檢測方法

LAMP 檢測方法是一種可視化、快速、特異的檢測方法，特別適合于基層和現(xiàn)場臨床樣品的快速檢測。董世娟等[3]建立了牛傳染性鼻氣管炎可視化LAMP 檢測方法，該方法根據(jù)牛傳染性鼻氣管炎病毒的保守序列g(shù)B 基因設(shè)計3 對LAMP 檢測引物，通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化和特異性試驗及敏感性試驗建立了牛傳染性鼻氣管炎可視化LAMP 檢測方法，最適反應(yīng)條件為65℃、50min 條件下擴增反應(yīng)，根據(jù)顏色變化判定結(jié)果。該方法的檢測下限為10 拷貝/μL 的質(zhì)粒DNA，敏感性比普通PCR 方法高很多，對牛病毒性腹瀉病毒、豬偽狂犬病毒、水泡口炎病毒等沒有交叉反應(yīng)，應(yīng)用該方法檢測393 份臨床樣本，301 份鼻腔拭子陽性率為87.6%，92 份血清樣本陽性率為58.8%，表明鼻腔拭子的檢出率更高，更適合臨床采樣，該檢測方法可以用于牛傳染性鼻氣管炎病毒的基層和現(xiàn)場臨床樣品的快速檢測。

4 膠體金檢測方法

膠體金檢測方法具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定、特異、結(jié)果易判等諸多優(yōu)點。梅力等[4]制備了牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體膠體金檢測試紙條，該試紙條采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達牛傳染性鼻氣管炎病毒gD 蛋白抗原，將gD 蛋白純化后用膠體金標記作為示蹤抗原，未標記的gD 蛋白抗原作為捕獲抗原，羊抗牛IgG 抗體作為質(zhì)控抗體，制備了牛傳染性鼻氣管炎病毒雙抗原夾心法膠體金檢測試紙條，該試紙條特異性好，靈敏度高，與牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒等陽性血清無交叉反應(yīng)，與IDEXX 牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA 檢測試劑盒的陽性符合率為93.5%，可以用于牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的臨床診斷和檢測。

5 結(jié)語

牛傳染性鼻氣管炎病毒是一種以呼吸道癥狀為主的病毒性傳染病，傳播迅速，對養(yǎng)牛業(yè)危害巨大，該病目前沒有特效治療藥物，只有加強疫苗免疫和疾病的快速診斷和隔離淘汰才是控制本病流行的最好方法，因此，建立快速的疾病診斷方法對防控本病至關(guān)重要，實際應(yīng)用中可以根據(jù)需要綜合運用各種實驗室檢測方法，更好的控制牛傳染性鼻氣管炎病毒的傳播和流行。